橘紅色花菜薹突變體的發(fā)現(xiàn)和研究

（北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，北京 100097）

菜薹〔Brassica campestrisL.ssp.chinensis（L.）Makino var.utilisTsen et Lee〕別名菜心、綠菜薹、菜尖，起源于我國(guó)南部，在廣東、廣西栽培歷史悠久，是易抽薹白菜經(jīng)長(zhǎng)期選擇和栽培馴化的產(chǎn)物，并演化為不同的類型和品種。菜薹質(zhì)地柔軟，風(fēng)味可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，不僅在南方地區(qū)普遍種植，近年來北方地區(qū)也有栽培。

突變體在植物品種改良上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。一方面，通過基因突變產(chǎn)生的突變體，可以創(chuàng)造出新的種質(zhì)資源，增加物種的遺傳多樣性；另一方面，突變體作為標(biāo)記性狀，可以輔助辨別親本和一代雜種，顯著提高商品種子的純度和質(zhì)量。同時(shí)，突變體在基因定位、克隆和基因表達(dá)、調(diào)控等分子生物學(xué)研究領(lǐng)域也具有重要意義。

菜薹的花色以黃色為主，但也存在其他花色。2011年5月，筆者在1份菜薹育種材料F3群體中發(fā)現(xiàn)了1株突變體，其花色為橘紅色。眾所周知，橘紅心大白菜的花色為橘紅色，是一種特殊的大白菜類型，其資源來源于日本。研究發(fā)現(xiàn)，大白菜橘紅心球色為質(zhì)量性狀，控制橘紅心球色的基因?yàn)殡[性單基因or（張德雙 等，2003）。橘紅心大白菜具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，VC含量306.0 mg·kg-1，β-胡蘿卜素含量2.6 mg·kg-1（FW），居所有類型大白菜品種之首，尤其是β-胡蘿卜素含量，更是普通大白菜品種的6倍以上（張德雙 等，2004）。

劉秀村等（2003）應(yīng)用大白菜DH 群體，獲得了1個(gè)與橘紅心大白菜球色基因緊密連鎖的RAPD 分子標(biāo)記OPB01845，遺傳距離為3.8 cM，并將其轉(zhuǎn)化為SCAR 標(biāo)記SCB01-845。隨后，又發(fā)現(xiàn)了1個(gè)與橘紅心球色基因連鎖的SCAR 標(biāo)記（王國(guó)臣 等，2007；Zhang et al.，2008），并最終將or基因定位在大白菜1號(hào)染色體的長(zhǎng)臂末端（于拴倉 等，2007）。Feng 等（2010）獲得了與橘紅心基因連鎖的3個(gè)SSR 標(biāo)記，其中sau（C）586、syau19 在or基因同側(cè)，遺傳距離分別為1.6 cM 和1.3 cM；syau15位于另一側(cè)，遺傳距離為3.3 cM。

本試驗(yàn)的目的是研究菜薹橘紅色花的遺傳規(guī)律，并應(yīng)用與大白菜橘紅心球色基因連鎖的SSR分子標(biāo)記對(duì)控制菜薹橘紅色花的基因進(jìn)行分析，鑒定菜薹的橘紅色花基因與大白菜的橘紅心球色基因or是否相同，為今后選育橘紅色花菜薹一代雜種和獲得新的橘紅心大白菜種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

橘紅色花菜薹11A-47 是筆者于2011年5月發(fā)現(xiàn)的1株突變體，其葉色為翠綠色，葉形為近橢圓 形，莖翠綠色，分枝較旺，花色為橘紅色，鮮艷且較深（圖1）。黃色花菜薹品種為聯(lián)記特選34號(hào)甜菜心，該材料已自交7代，遺傳性狀穩(wěn)定、純合，葉色深綠，葉形為圓形，莖綠色，分枝較旺，花色為黃色。供試材料均來源于北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心白菜課題組。

圖1 橘紅色花菜薹突變體11A-47

1.2 方法

1.2.1 子葉顏色調(diào)查方法 2011年5月，在本中心對(duì)橘紅色花菜薹11A-47 進(jìn)行自交留種；同時(shí)以11A-47 為父本，與黃色花菜薹進(jìn)行雜交，獲得F1種子。2012年6月初，F(xiàn)1自交獲得F2，再以F1為母本分別與黃色花菜薹、11A-47 雜交，分別獲得BC1和BC1′。參考耿新翠等（2012）的方法并加以改進(jìn)，調(diào)查子葉顏色：7月初，將P1、P2、F1、F2、BC1和BC1′6個(gè)世代的種子放置在4℃冰箱中，低溫遮光處理15 d后取出，用肉眼觀測(cè)子葉顏色，記錄并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。然后，將6個(gè)世代種子分別播種到50 孔穴盤中，直到開花，調(diào)查并記錄各單株花瓣顏色。

1.2.2 根部和髓部顏色調(diào)查方法 2012年7月初，待11A-47 和黃色花菜薹的自交種子收獲結(jié)束后，拔取11A-47 與黃色花菜薹各20株，將菜薹根部洗凈，比較11A-47 與黃色花菜薹的根部顏色。再將根部橫切即獲得髓部，比較二者髓部顏色。

1.2.3 花蕾和花瓣顏色調(diào)查方法 在菜薹盛花期，比較11A-47 與黃色花菜薹的花蕾及花瓣顏色。

1.2.4 分子標(biāo)記方法 以來源于大白菜R9 連鎖群（即大白菜1號(hào)染色體）、并與橘紅心球色基因or連鎖的11對(duì)SSR 引物對(duì)黃色花大白菜、橘紅色花大白菜、黃色花菜薹和11A-47 進(jìn)行標(biāo)記分析。引物分別為Feng 等（2010）的5 對(duì)SSR 引物sau（N）033、sau（C）586、syau15、syau19、ENA21，本中心耐寒類蔬菜育種研究室設(shè)計(jì)的5 對(duì)SSR 引物ba14066、PD7413、PD1355、PD6142、PD7418 和Wang 等（2011）的1對(duì)SSR 引物BRID90153。

反應(yīng)體系（12.5 μL）：1μL 50 ng 模板 DNA，0.6 μL dNTP（2.5 mmol·mL-1），1.25 μL 10×buffer（含Mg2+），上下游引物各0.8 μL（0.5 μmol·mL-1），0.15 μLTaq酶，7.9 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)程序：95℃ 3 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用3%超高分辨率瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 橘紅色花菜薹突變體11A-47 的植物學(xué)性狀

2.1.1 橘紅色花菜薹子葉顏色的遺傳規(guī)律 橘紅色花菜薹突變體11A-47 6個(gè)世代各單株子葉顏色和卡方檢測(cè)結(jié)果見表1和圖2。親本P1為普通黃色花菜薹，子葉顏色全部為綠色；親本P2為橘紅色花菜薹，子葉顏色全部為桔紅色，二者雜交F1的子葉顏色均為綠色，說明橘紅色花對(duì)黃色花為隱性；F2世代子葉顏色出現(xiàn)了分離，橘紅色與綠色單株的分離比例符合1∶3，χ2=1.938 9 ＜χ20.05=3.841；BC1世 代中橘紅色單株數(shù)量很少，約占4.36%；BC1′世代中橘紅色與綠色單株的分離比例符合1∶1，χ2=1.369 7 ＜χ20.05=3.841。

2.1.2 橘紅色花菜薹根部和髓部顏色 11A-47 與黃色花菜薹根部、髓部顏色見圖3和圖4。11A-47 的根部、髓部顏色均表現(xiàn)為橘紅色，而黃色花菜薹的根部、髓部顏色均表現(xiàn)為白色。據(jù)報(bào)道，絕大多數(shù)類胡蘿卜素呈黃色、橘紅色或紅色，是許多花、果實(shí)和胡蘿卜根呈現(xiàn)各種顏色的原因（Bartley & Scolnik，1995）。橘紅心大白菜葉球之所以呈現(xiàn)橘紅色，就是由于高含量β-胡蘿卜素等類胡蘿卜素的積累所致（Bartley & Scolnik，1995；張華敏 等，2009）。本試驗(yàn)中，橘紅色花菜薹11A-47 的根部、髓部顏色均為橘紅色，充分表明這些器官積累了類胡蘿卜素。

2.1.3 橘紅色花菜薹花蕾和花瓣顏色 11A-47 與黃色花菜薹花蕾、花瓣顏色見圖5 和圖6。11A-47 的花蕾顏色為淺綠色，花瓣為桔紅色，花色鮮艷且較深。而黃色花菜薹花蕾顏色為綠色，花瓣為黃色。

表1 黃色花菜薹×11A-47 各世代子葉顏色和卡方檢測(cè)結(jié)果

2.2 SSR分子標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果

11對(duì)SSR 引物對(duì)黃色花大白菜、橘紅色花大白菜、黃色花菜薹和11A-47 的擴(kuò)增結(jié)果見圖7 和表2。其中，BRID90153、PD1355、sau（N）033、sau（C）586、syau15、syau19 等6 對(duì)引物可在11A-47 與橘紅色花大白菜基因型中擴(kuò)增出差異產(chǎn)物，而其余5 對(duì)引物則沒有擴(kuò)增出差異產(chǎn)物。由此可見，控制菜薹11A-47 橘紅色花的基因與控制大白菜橘紅心球色的基因可能不同。

圖2 黃色花菜薹×11A-47 6個(gè)世代各單株子葉顏色

圖3 11A-47 與黃色花菜薹的根部顏色

圖4 11A-47 與黃色花菜薹的髓部顏色

圖5 11A-47 與黃色花菜薹的花蕾顏色

圖6 11A-47 與黃色花菜薹的花瓣顏色

圖7 SSR 引物擴(kuò)增結(jié)果

表2 11對(duì)SSR 引物的擴(kuò)增結(jié)果

3 結(jié)論與討論

突變體的創(chuàng)建方法主要有自發(fā)突變、物理誘變、化學(xué)誘變，T-DNA、轉(zhuǎn)座子、反轉(zhuǎn)座子插入等，其中自發(fā)突變是自然界普遍存在的變異。在育種實(shí)踐中，一旦發(fā)現(xiàn)了具有某種有利性狀的突變體，通過研究其遺傳規(guī)律并加以應(yīng)用，最終可選育出具有該性狀的優(yōu)良品種。

3.1 11A-47 突變體的來源

菜薹花色發(fā)生自然變異的可能性比較大。筆者發(fā)現(xiàn)的橘紅色花菜薹突變體11A-47 來源于1份自交2 代的F3菜薹群體。11A-47 突變體除了花色為橘紅色外，其余性狀與黃色花菜薹相似，其葉色翠綠色，葉形近橢圓形，葉柄長(zhǎng)，莖翠綠色，腋芽萌發(fā)能力較強(qiáng)；且不具有菜薹與大白菜雜交后代產(chǎn)生的中間性狀，如葉翼等。因此，可以肯定地說，菜薹突變體11A-47 的橘紅色花基因不是來源于橘紅心大白菜，而是菜薹自然突變的產(chǎn)物。在調(diào)查菜薹育種材料性狀時(shí)，除了花色為橘紅色的突變體11A-47 外，筆者還發(fā)現(xiàn)了以白色為主且嵌有黃色的花色突變體，并可以穩(wěn)定遺傳。

3.2 BC1 群體中橘紅色子葉單株存在的原因

本試驗(yàn)是以子葉顏色來確定橘紅色花或黃色花單株的。BC1群體中存在極少數(shù)橘紅色子葉單株的可能原因主要有：① 在調(diào)查子葉顏色時(shí)，將個(gè)別原本為綠色子葉的單株誤定為橘紅色子葉；② 因F1花粉去雄不徹底而自交，產(chǎn)生少部分F2種子，混在BC1回交群體中。為了重復(fù)本試驗(yàn)，筆者還播種了另外2份BC1回交群體，仍然發(fā)現(xiàn)具有橘紅色子葉的個(gè)別單株，橘紅色子葉與綠色子葉的比例分別是6∶85 和2∶101。同時(shí)，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在盛花期，BC1回交群體依然存在橘紅色花的植株，因此，今后的重點(diǎn)是嚴(yán)格拔除F1雄蕊，重新獲得BC1群體，并進(jìn)一步驗(yàn)證上述試驗(yàn)結(jié)果。

3.3 菜薹橘紅色花基因與大白菜橘紅心球色or基因的異同

控制菜薹橘紅色花的基因與大白菜橘紅心球色or基因的遺傳規(guī)律一致，即菜薹橘紅色花、大白菜橘紅心球色均為質(zhì)量性狀，由1對(duì)隱性等位基因控制。本試驗(yàn)應(yīng)用11對(duì)與大白菜橘紅心球色基因連鎖的SSR分子標(biāo)記對(duì)11A-47 進(jìn)行分析，其中6 對(duì)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物能夠準(zhǔn)確區(qū)分11A-47、橘紅心球色大白菜，但這6 對(duì)引物也可在黃色花大白菜或黃色花菜薹中擴(kuò)增出相同的產(chǎn)物，即無法將黃色花大白菜、橘紅色花大白菜、黃色花菜薹和11A-47 同時(shí)區(qū)分開。由目前的研究結(jié)果初步分析可見，控制菜薹11A-47 橘紅色花的基因與控制大白菜橘紅心球色的基因可能不同。下一步，將對(duì)控制11A-47 橘紅色花的or基因進(jìn)行染色體初步定位，進(jìn)一步證明二者間的關(guān)系。

本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，PD7413、PD7418、sau（N） 033、syau15、syau19 和ENA21 等6 對(duì)引物雖然已被成功用于區(qū)分黃色花和橘紅色花大白菜基因型，但在本試驗(yàn)中并沒有在橘紅色花大白菜基因型中擴(kuò)增出差異產(chǎn)物，可能是由于試驗(yàn)采用的電泳檢測(cè)方法（丙烯酰胺凝膠和超高分辨率瓊脂糖凝膠）不同或這些引物與大白菜橘紅心球色or基因連鎖的不緊密等原因造成的。

3.4 菜薹橘紅色花基因的應(yīng)用

筆者已經(jīng)開始利用11A-47 和白心大白菜進(jìn)行雜交，希望獲得表現(xiàn)更優(yōu)的大白菜橘紅心育種資源，并進(jìn)一步育成橘紅心新品種。另外，菜薹的橘紅色花基因可以使其根部和髓部變?yōu)殚偌t色，因此采用生物技術(shù)方法有可能將該基因轉(zhuǎn)到蘿卜等食用根部器官的蔬菜中，創(chuàng)造出更多具有橘紅色性狀的蔬菜新資源。

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