反相高效液相色譜法測(cè)定秋葵干蔬中的β-胡蘿卜素

董愛(ài)軍，楊 鑫，張英春，張 華，井 晶

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090）

秋葵是一種高檔營(yíng)養(yǎng)保健蔬菜，它是名副其實(shí)的藥食兼?zhèn)涞母郀I(yíng)養(yǎng)強(qiáng)身健體植物[1]，既可以作為蔬菜直接食用，也可以作為湯料的輔助成分，以及蛋白質(zhì)和脂肪的替代品[2-3]。但秋葵儲(chǔ)存期短，即使低溫儲(chǔ)存，也只有2～3d的保鮮期。為了延長(zhǎng)秋葵的儲(chǔ)存期，傳統(tǒng)的方法是將秋葵烘干或曬干制成秋葵干蔬[4]，速凍也是常用的保鮮方法，速凍產(chǎn)品保鮮期可達(dá)9個(gè)月[5]，干制產(chǎn)品最長(zhǎng)可保存一年。

為了評(píng)價(jià)秋葵的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，人們對(duì)于秋葵中功能成分及營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了深入的研究，如多酚化合物[6]、多糖[7]、微量元素[8]等藥用成分的分析研究，蛋白質(zhì)、糖、脂肪等營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定[9-10]，胡蘿卜素和類胡蘿卜素的組成分析等[11-12]。秋葵嫩莢富含維生素，尤其是維生素A與胡蘿卜素含量在目前發(fā)現(xiàn)的動(dòng)植物中位列第一。β-胡蘿卜素是維生素A的前體，同時(shí)β-胡蘿卜素具有很強(qiáng)的抗氧化功能[13]和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[14-15]。但β-胡蘿卜素不穩(wěn)定，極易被光、熱、氧、金屬離子等破壞，因此研究分析秋葵干蔬中β-胡蘿卜素的含量，對(duì)于選擇適當(dāng)?shù)母芍品椒ň哂兄笇?dǎo)意義，同時(shí)對(duì)于評(píng)價(jià)秋葵干蔬的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值也有重要的意義。液相色譜法以其靈敏度高，快速準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)在β-胡蘿卜素的測(cè)定中得到了廣泛的應(yīng)用[16-19]，但大部分方法采用回流皂化法，樣品處理繁瑣，很難實(shí)現(xiàn)全程避光，β-胡蘿卜素的破壞較大。本實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)化樣品處理過(guò)程，建立了RP-HPLC測(cè)定秋葵干蔬中β-胡蘿卜素含量的方法。該方法樣品處理方法簡(jiǎn)單，β-胡蘿卜素的破壞較小，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β-胡蘿卜素 Sigma公司；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷 為色譜純；氫氧化鉀、無(wú)水硫酸鈉、抗壞血酸、無(wú)水乙醇 為分析純。

Agilent 1100型高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司，配備四元梯度泵，100位自動(dòng)進(jìn)樣器，二極管陣列檢測(cè)器（DAD），化學(xué)工作站；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；millipore purification system超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 干燥秋葵樣品用粉碎機(jī)粉碎后，過(guò)20目篩，備用。準(zhǔn)確稱取10.00g粉碎的秋葵樣品于250m L具塞錐形瓶中，加1g抗壞血酸，再加入70m L無(wú)水乙醇，混勻，加入30m L 50%的KOH溶液，充入氮?dú)?m in，蓋好瓶塞，并用保鮮膜和皮筋將瓶塞扎實(shí)，錫箔紙包好后，室溫下放置過(guò)夜皂化22～24h。用150m L正己烷分3次萃取皂化液，合并正己烷層，并用高純水將其洗至中性后，過(guò)無(wú)水硫酸鈉脫水。在45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用正己烷定容至10m L，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后，取20μL進(jìn)行液相色譜分析。整個(gè)操作過(guò)程注意避光。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為Agilent TC-C18柱（250mm×4.6mm，i.d.5μm）；流動(dòng)相為乙腈-甲醇-乙酸乙酯（88∶10∶2，V∶V∶V），流速1m L/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為453nm。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)使用液 準(zhǔn)確稱取β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品0.1000g，用正己烷溶解并準(zhǔn)確定容于100m L棕色瓶中，配制成濃度為1000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20℃冰箱中避光保存。準(zhǔn)確吸取該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10m L，用正己烷定容至100m L，配制成濃度為100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液，于4℃冰箱中避光保存。此標(biāo)準(zhǔn)使用液需現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液 準(zhǔn)確吸取0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0m L標(biāo)準(zhǔn)使用液于100m L棕色瓶中，用正己烷定容，配制成β-胡蘿卜素濃度分別為0.1、0.5、1、2、5、10mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.4 定量方法 取各濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按上述色譜條件進(jìn)行分析，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸。將處理后的樣品溶液在相同條件下進(jìn)行分析，以保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的選擇

β-胡蘿卜素是一種脂溶性的物質(zhì)，存在于脂肪之內(nèi)。干秋葵種子中含有較多的脂肪，為了使樣品中的β-胡蘿卜素與脂肪分離，本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)的皂化法處理樣品。β-胡蘿卜素不穩(wěn)定，光、氧、熱和金屬離子都能使其分解損失，尤其對(duì)光極不穩(wěn)定。為了保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度，減少β-胡蘿卜素的損失，采用室溫過(guò)夜皂化法。加入抗壞血酸作為抗氧化劑，同時(shí)充入氮?dú)庖苑乐功?胡蘿卜素氧化，在室溫下皂化以防止β-胡蘿卜素的受熱損失，為了防止光對(duì)β-胡蘿卜素的破壞，整個(gè)樣品處理過(guò)程都避光。本實(shí)驗(yàn)比較了正己烷、石油醚、乙醚的萃取效果，用正己烷萃取時(shí)，β-胡蘿卜素回收率比其他兩種萃取劑高10%左右，因此本實(shí)驗(yàn)選擇正己烷為β-胡蘿卜素的萃取劑。

2.2 色譜條件選擇

2.2.1 流動(dòng)相的選擇 反相高效液相色譜法測(cè)定β-胡蘿卜素的流動(dòng)相有乙腈-二氯甲烷-甲醇[17，19]、甲醇-乙腈-三乙胺[18]、環(huán)己烷-正己烷-異丙醇[20]、乙腈-甲醇-乙酸乙酯[21]、甲醇-異丙醇[22]等，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-甲醇-乙酸乙酯作流動(dòng)相，并對(duì)三者的配比進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，分別為：88∶10∶2，90∶5∶5，95∶0∶5。由于β-胡蘿卜素含有共軛雙鍵，極性很弱，因此提高乙腈和乙酸乙酯的比例能使保留時(shí)間縮短，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著乙腈和乙酸乙酯的增加，β-胡蘿卜素的保留時(shí)間雖然有所縮短，但峰面積卻小了很多，綜合考慮最終確定乙腈-甲醇-乙酸乙酯的比例為88∶10∶2，β-胡蘿卜素的保留時(shí)間為45m in。

2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 液相色譜法測(cè)定β-胡蘿卜素的檢測(cè)波長(zhǎng)有250nm[19]、450nm左右[16，19-20，22]，實(shí)驗(yàn)前用二極管陣列檢測(cè)器在190～900nm范圍內(nèi)，對(duì)β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行在線光譜掃描，光譜信號(hào)顯示：β-胡蘿卜素在453nm有最大吸收峰。本實(shí)驗(yàn)比較了β-胡蘿卜素在250、450、453nm的吸收值，結(jié)果表明β-胡蘿卜素在453nm的吸收值更高一些，這與在線光譜掃描的結(jié)果一致。因此本實(shí)驗(yàn)確定在453nm波長(zhǎng)下檢測(cè)秋葵中的β-胡蘿卜素，標(biāo)準(zhǔn)品和干燥秋葵加標(biāo)樣品色譜圖，見(jiàn)圖1。

圖1 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品和秋葵干蔬加標(biāo)樣品色譜圖Fig.1 Chromatograms ofβ-carotene standard and dry okra sample spiked 100μg

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍和檢出限 將混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按

1.2.2 的色譜條件進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)（y），標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)（X），作工作曲線并進(jìn)行線性回歸，β-胡蘿卜素在0.1～10.0mg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=104.13x+39.62，相關(guān)系數(shù)R2=0.996。按3倍信噪比（S/N），確定本方法的檢出限（LOD）為0.08mg/kg，10倍信噪比（S/N），確定本方法的定量下限（LOQ）為0.26mg/kg。

2.3.2 回收率和精密度 準(zhǔn)確稱取干燥秋葵樣品10.00g，按高、中、低三個(gè)濃度水平加標(biāo)，每個(gè)水平重復(fù)三次，進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，由回歸方程計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表1。β-胡蘿卜素的回收率為82.4%～94.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.28%～5.43%，表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度都較高，能夠滿足實(shí)際測(cè)定需要。

表1 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）Table1 Recovery ofβ-carotene and relative standard deviation（n=3）

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 光和熱對(duì)β-胡蘿卜素的穩(wěn)定性有很大的影響，避光和4℃儲(chǔ)存效果最佳[22]。為了考察β-胡蘿卜素的穩(wěn)定性，將濃度為5mg/L的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液在4℃下避光放置，每隔2h測(cè)定其響應(yīng)值，并計(jì)算濃度。結(jié)果表明，β-胡蘿卜素濃度變化的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），日內(nèi)為3.58%，日間為6.73%。因此測(cè)定β-胡蘿卜素時(shí)，為了減少損失，標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，并且標(biāo)樣配制和樣品處理過(guò)程都應(yīng)避光，低溫放置。

2.4 秋葵干蔬中測(cè)定

采用上述方法測(cè)定了10個(gè)秋葵干蔬樣品中的β-胡蘿卜素的含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果均未檢出β-胡蘿卜素。鮮秋葵中β-胡蘿卜素的含量平均為92.4mg/kg，本實(shí)驗(yàn)中的樣品是在陽(yáng)光下自然曬干的，由于紫外線對(duì)β-胡蘿卜素的破壞力極強(qiáng)，未檢出說(shuō)明自然曬干的秋葵干蔬中的β-胡蘿卜素已經(jīng)被完全破壞了。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了測(cè)定秋葵干蔬中β-胡蘿卜素的反相高效液相色譜法，樣品經(jīng)室溫過(guò)夜皂化后，由C18柱分離，二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)。該方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，不僅適合干制秋葵中β-胡蘿卜素的測(cè)定，也可應(yīng)用于新鮮秋葵和速凍秋葵中β-胡蘿卜素的測(cè)定。該方法的建立對(duì)于選擇適宜的秋葵保鮮方法，減少β-胡蘿卜素的損失具有指導(dǎo)意義。

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