連翹葉提取物抑菌作用以及穩(wěn)定性研究

原江鋒，王大紅，何靈美，閆國琦，張清安

(1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽471003; 2.山西芳靈貿(mào)易有限責(zé)任公司，山西太原030045; 3.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062)

食品的腐敗變質(zhì)主要由微生物引起［1］，食品防腐劑在延長食品貯藏期、保證食品品質(zhì)的過程中具有非常重要的作用。傳統(tǒng)食品防腐劑是以化學(xué)合成品多見，由于化學(xué)合成的防腐劑涉及到安全性問題，許多國家已逐步禁止或限制使用。因此研究天然食品防腐劑已經(jīng)成為食品科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點。伏牛山區(qū)中藥資源占河南省總數(shù)的76.9%，藥用植物的品種數(shù)量和儲存量均位于全國前列，是全國藥用植物主要產(chǎn)區(qū)之一，其中連翹年產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的40%。伏牛山區(qū)連翹果實中連翹苷和連翹酯苷的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他地區(qū)［2］;近年來的研究發(fā)現(xiàn)連翹葉中有效成分如連翹苷、連翹脂苷、蘆丁等的含量高于果實［3-4］。由于連翹葉沒有進(jìn)入國家藥典，因此連翹葉資源尚未得到足夠的開發(fā)利用，造成大量的連翹葉片被遺棄，將連翹葉提取物作為天然防腐劑應(yīng)用在食品工業(yè)中，既可以提升連翹葉的價值，又可以為食品工業(yè)發(fā)掘新原料。本研究在伏牛山地區(qū)FSLE抗菌性能的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究熱處理、pH、紫外線、氧化劑和金屬離子對連翹葉提取物(Forsythia Suspensa leaves extract，F(xiàn)SLE)抑菌穩(wěn)定性的影響，為伏牛山地區(qū)FSLE開發(fā)成安全可靠的食品天然防腐劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

連翹葉采自河南省伏牛山地區(qū)，自然晾干，對其進(jìn)行研磨粉碎備用。銀杏葉提取物是河北天成藥業(yè)股份有限公司市售產(chǎn)品(總黃酮醇苷9.6mg/g，萜類內(nèi)酯2.4mg/g)。指示菌:細(xì)菌包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和大腸桿菌(Escherichia coli);真菌包括黑曲霉(Aspergillus niger)、根霉(Rhizopus);以上菌種均由河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實驗教學(xué)中心提供。指示菌培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基［5］。

RE2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;HK-02A手提式粉碎機(jī) 廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司; LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;BS210S分析天平 北京賽利斯天平有限公司;DL-5-B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;202電熱恒溫干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市江南儀器廠; YQDL201，YQDL204微量移液器 北京東林昌盛生物科技有限公司;HPS-250生化培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 FSLE的制備 連翹葉以1∶10(w∶w)比例加蒸餾水，于80℃提取30m in后過濾，濾渣再重復(fù)煎煮兩次，合并3次濾液，濃縮干燥至浸膏，臨用前用不同條件處理后配成5%溶液濃度。

1.2.2 菌種活化及菌懸液的制備［6］將所有供測試的細(xì)菌和真菌分別接種于牛肉膏蛋白胨和PDA固體斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，霉菌置28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，連續(xù)傳代2次。將上述活化好的各種菌分別挑取一環(huán)制成初試菌懸液，取適量初試菌懸液用生理鹽水將其稀釋成含菌量為106～107CFU/m L的菌懸液備用。

1.2.3 FSLE抑菌性實驗［7］將吸水性強(qiáng)的濾紙片用打孔器制成直徑為6mm的圓形濾紙片。將濾紙高壓滅菌后用無菌鑷子將濾紙片浸入無菌水、質(zhì)量濃度為5%無菌過濾的FSLE和銀杏葉提取物的溶液中30m in，烘干備用。分別在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基或PDA表面加入0.2m L供試菌的菌懸液，用無菌涂布器涂布均勻，15min后用無菌鑷子夾取濾紙片貼于涂菌平板上。細(xì)菌于37℃恒溫培養(yǎng)24h，霉菌于28℃恒溫培養(yǎng)48h，觀察菌落生長情況，采用十字交叉法測定抑菌圈兩個垂直方向的直徑大小，取其平均值(mm)為測定結(jié)果，每項抑菌實驗均平行重復(fù)3次。以上操作均在超凈工作臺上完成。

1.2.4 溫度對FSLE穩(wěn)定性的影響［8］將FSLE分別在80、100、121℃處理30min，用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為5%的溶液，無菌過濾。以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，按1.2.3方法測定其抑菌活性。

1.2.5 pH對 FSLE抗菌效果的影響［9］用1mol/L HCl和NaOH溶液把質(zhì)量濃度為5%FSLE調(diào)至pH4、5、6、7、8、9，無菌過濾，平衡24h后以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后測定抑菌圈直徑大小，實驗重復(fù)3次。

1.2.6 紫外照射對FSLE抑菌活性的影響［10］稱取若干份樣品，分別置于20W的紫外等下照射10、30、60、90、120m in，用蒸餾水配成5%的樣液，無菌過濾。同樣以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，每項抑菌實驗均平行重復(fù)3次。

1.2.7 氧化劑對FSLE抑菌活性的影響 將FSLE配制成含3%H2O2的5%的樣液，無菌過濾后測定對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率。以未處理的樣品作為對照，實驗均重復(fù)3次。

1.2.8 金屬離子對FSLE穩(wěn)定性的研究［9］用1mol/L的不同金屬離子(Na+、K+、Ca2+、Cu2+、Fe3+)溶液浸泡FSLE，將處理過的FSLE配制成5%的樣液，12h后測定其抑菌活性，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 FSLE的抑菌活性測定

由表1可知，F(xiàn)SLE對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，其次是對大腸桿菌的抑制作用，對枯草芽孢桿菌的抑制作用較弱;而對根霉和黑曲霉無抑制作用。對不同的供試菌種的抑制效果在淡竹葉提取物中也有相同結(jié)果報道［11］。因此選取大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌作為對FSLE的穩(wěn)定性實驗的菌種。

表1 FSLE和銀杏葉提取物對常見菌的抑制效果Table1 Inhibitory effect of Forsythia Suspensa leaves extract and Ginkgo leaves extract on common bacteria strains

這一特點提示:FSLE添加于食品中對細(xì)菌類具有較強(qiáng)的抑制活性，對真菌類的抑制還需要其它的防腐劑配合使用。由表1還可以看出，連翹葉提取物和陽性對照銀杏葉提取物的抑菌活性相比，F(xiàn)SLE具有較強(qiáng)的活性。

2.2 溫度對FSLE抑菌活性的影響

圖1 溫度對FSLE抑菌的影響Fig.1 The impact of temperature on the Forsythia Suspensa leaves extract antibacterial

由圖1可知，隨溫度上升，其抑菌效果呈下降趨勢，說明溫度對FSLE的抑菌活性有一定的影響。但總體來說，F(xiàn)SLE在80～121°C范圍內(nèi)處理30min仍具有較強(qiáng)的抑菌效力，表明FSLE比較穩(wěn)定，不易產(chǎn)生熱變性，具備在食品中的使用要求。這與陳佳佳［12］得出桑葉提取物具備良好抗熱性的結(jié)論一致。這一熱穩(wěn)定性的特點提示:FSLE即使添加于需進(jìn)行加熱處理的食品中，也可穩(wěn)定保持其抗菌防腐性能，可作為熱加工食品中的防腐劑。

2.3 pH對FSLE抑菌作用的影響

pH對FSLE抑菌作用的影響見圖2，在pH6時，F(xiàn)SLE抑菌效果達(dá)到最好，當(dāng)pH≤5或pH≥7時，隨著FSLE處理的pH逐漸降低或升高，F(xiàn)SLE的抑菌效果均會逐漸降低?？赡茉蚴牵琾H升高或降低，改變了提取物有效抑菌成分結(jié)構(gòu);而在中性和弱酸的環(huán)境下FSLE的結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，具有較強(qiáng)的抑菌活性。這一特點提示，F(xiàn)SLE作為防腐劑添加在食品中，在中性和弱酸性環(huán)境中抑菌活性較強(qiáng)。

圖2 FSLE在不同pH下的抑菌活性Fig.2 The antibacterial activity of Forsythia Suspensa leaves extract at different pH

2.4 紫外線對FSLE抑菌作用的影響

紫外照射實驗結(jié)果由圖3可知，F(xiàn)SLE經(jīng)不同時間的紫外照射后，在少于30m in對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制能力幾乎沒有影響，但是在30～120min范圍，F(xiàn)SLE的抑菌能力有所影響;而紫外線照射對FSLE對大腸桿菌的抑菌能力影響一直較大。由此看出對于不同菌種，F(xiàn)SLE的抑菌活性具有不同的紫外光穩(wěn)定性，推測原因為FSLE對不同菌種的抑菌機(jī)制存在差異。這一特點提示，環(huán)境中的紫外線的存在和長時間照射可能會影響到FSLE抑菌性能的發(fā)揮。

圖3 紫外照射對FSLE抑菌效果的影響Fig.3 Effect of ultraviolet on antibacterial activity of Forsythia Suspensa leaves extract

2.5 氧化劑對FSLE穩(wěn)定性的影響

由圖4可以看出，氧化劑H2O2對FSLE的穩(wěn)定性影響較大，可能原因是FSLE有效抑菌成分大多含不飽和雙鍵和其他可氧化基團(tuán)，使得氧對FSLE的有效抑菌成分造成破壞，從而導(dǎo)致其有效抑菌成分濃度的降低，所以FSLE應(yīng)密封保藏。這一特點提示: FSLE作為防腐劑，應(yīng)避免長期與空氣接觸造成其抑菌效果的降低的問題。

圖4 氧化劑對連翹葉抑菌的影響Fig.4 Effect of oxidants on the Forsythia Suspensa leaves extract antibacterial

2.6 金屬離子穩(wěn)定性的研究

由圖5可以看出，經(jīng)Na+、K+處理后，F(xiàn)SLE仍具有較強(qiáng)抑菌性能，但與未處理組相比，抑菌活性略有下降。而經(jīng)鈣、銅、鐵離子處理后其抑菌活性稍提高，其原因可能是重金屬及過渡金屬離子本身對菌體的生長存在抑制作用。這一特點提示:FSLE作為防腐劑可以應(yīng)用在含有鈉、鉀、鈣、銅和鐵等金屬離子較豐富的食品中。

圖5 金屬離子對提取物抑菌活性的影響Fig.5 Effect ofmetal ions on antimicrobial activity of Forsythia Suspensa leaves extract

3 結(jié)論

3.1 本實驗中，F(xiàn)SLE對所試三種細(xì)菌具有比較好的抑制作用，而對所試真菌的抑制效果不明顯。植物中的提取物中如萜烯類、生物堿、類黃酮、甾類、酚類、獨特的氨基酸和多糖等都具有殺蟲和抗菌活性，本課題組下一步將進(jìn)行FSLE主要抑菌活性物質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)分析研究，從而明確抑菌的物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.2 FSLE的抑菌活性具有良好的熱穩(wěn)定性;在中性和弱酸性環(huán)境中FSLE抑菌活性較強(qiáng);在大于30m in紫外線照射對FSLE抑制枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌活性有一定影響;對大腸桿菌的影響較大;應(yīng)盡量減少FSLE在空氣中的暴露時間;不同的金屬離子對FSLE抑菌性能影響不同，這些都是在實際應(yīng)用中需要切實考慮的問題。

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