梓醇通過(guò)上調(diào)p-Akt 表達(dá)抑制慢性腦缺血誘導(dǎo)的大鼠腦白質(zhì)損傷

蔡其燕，姚忠祥 (第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部:.組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室;.生理學(xué)教研室，重慶400038)

腦白質(zhì)損傷常與神經(jīng)退行性疾病伴發(fā)，但其發(fā)病機(jī)制目前尚未得到完全闡明。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)慢性腦缺血可導(dǎo)致腦白質(zhì)出現(xiàn)廣泛的少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡、髓鞘脫失、軸突損傷等病理改變［1-2］。因此尋找有效的藥物治療慢性腦缺血將有助于延緩腦白質(zhì)損傷及神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。梓醇是一種環(huán)烯醚萜葡萄糖苷類化合物，主要存在于地黃等植物中。研究發(fā)現(xiàn)梓醇可抑制缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡［3-4］。但其對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用，尚屬未知。最近研究報(bào)道梓醇可通過(guò)Akt 通路抑制H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［5］，這提示梓醇的保護(hù)作用可能與Akt 通路的激活有關(guān)。本研究通過(guò)永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈建立慢性腦缺血模型，檢測(cè)梓醇對(duì)腦白質(zhì)的保護(hù)作用及其與Akt 通路的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組

18 只成年雄性 Wistar 大鼠，體質(zhì)量 250 ～300 g，購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sha 組)，生理鹽水處理組(Veh 組)和梓醇處理組(Cat組)，每組 6 只。

1.2 大鼠慢性腦缺血模型制備和給藥方法

大鼠術(shù)前禁食12 h、禁水4 h。腹腔注射1%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，采用頸部正中切口，暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用雙重絲線分別在近心端和遠(yuǎn)心端進(jìn)行結(jié)扎，在結(jié)扎兩端中間剪斷。術(shù)中控制溫度在36.5 ～37.5 ℃。Sha 組不結(jié)扎和剪斷頸總動(dòng)脈，其余步驟和模型組相同。Veh 組和Cat 組大鼠分別于術(shù)后腹腔注射生理鹽水和梓醇(5 mg/kg)，每天1 次，連續(xù)10 d。

1.3 腦組織切片的制備

慢性腦缺血30 d 后，用1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，暴露心臟，用穿刺針插入右心室，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，生理鹽水灌注，至流出液體變清后，再灌注2.5%的Zamboni’s 固定液約300 mL。斷頭取腦，置于Zamboni’s 液中固定24 h。腦組織塊用30%蔗糖液脫水至沉入瓶底。OCT 包埋，在有胼胝體區(qū)域連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚20 μm。

1.4 盧卡斯快藍(lán)染色

腦片經(jīng)0.01 mol/L PBS 充分漂洗后裱片于鉻釩明膠包被的載玻片上，37 ℃烤片2 h;置于1% 盧卡斯快藍(lán)(luxol fast blue，LFB)染液中染色8 h(60 ℃);95%酒精洗去多于染液，轉(zhuǎn)入蒸餾水中充分漂洗;0.05%碳酸鋰溶液分色20 s，蒸餾水漂洗;70%酒精繼續(xù)分色至灰質(zhì)和白質(zhì)能明顯區(qū)分;自來(lái)水沖洗后，用梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

1.5.1 免疫酶標(biāo)染色 腦片經(jīng) 0.01 mol/L PBS 充分漂洗后，用3%雙氧水于室溫處理15 min，PBS 漂洗3 次(每次5 min)，用5%BSA 于37 ℃作用30 min 封閉抗體的非特異性結(jié)合。加一抗(APC 小鼠單克隆抗體，1 ∶100，Calbiochem 公司;MBP 山羊多克隆抗體，1∶200，Santa Cruz 公司;p-Akt 兔多克隆抗體，1∶100，Cell signaling 公司)，4 ℃ 過(guò)夜。生物素標(biāo)記二抗(1∶100)，37 ℃ 孵育 2 h，PBS 漂洗 3 次。SABC 復(fù)合物(Vector公司)，37 ℃孵育 1 h，DAB 顯色后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察并照相。以0.01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。用Image-Plus Pro 5.0 軟件計(jì)算免疫陽(yáng)性光密度值和免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.5.2 免疫熒光雙標(biāo)染色 腦片經(jīng)PBS 充分漂洗后，用5%BSA 于37 ℃作用30 min 封閉抗體的非特異性結(jié)合。切片同時(shí)加入 APC(1∶100)和 caspase-3(1∶100)抗體，或 APC(1∶100)和p-Akt(1∶100)抗體，37 ℃孵育 2 h 后，于 4 ℃孵育過(guò)夜。PBS 漂洗3 次后，同時(shí)加入Cy3 標(biāo)記的兔抗小鼠和FITC 標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗(1∶100，Abcam 公司)，37 ℃ 避光孵育 3 h，PBS 漂洗，用水溶性封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并照相。Image-Plus Pro 5.0 軟件計(jì)算雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 梓醇抑制腦白質(zhì)少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示(圖1a、b、c、g)Sha 組胼胝體內(nèi)APC 陽(yáng)性的少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)較多，Veh 組的少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)與Sha 組比較明顯減少(P ＜0.01)。梓醇治療后，Cat 組胼胝體的少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)明顯增多，與Veh 組比較，具有顯著性差異(P ＜0.05)。APC 與 caspase-3 免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示(圖1d、e、f、h)Sha 組胼胝體內(nèi)雙陽(yáng)性的凋亡少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)較少，Veh 組雙陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞數(shù)與 Sha 組比較明顯增多(P ＜0.01)。梓醇治療后，凋亡的少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)明顯降低，與Veh 組比較，有顯著性差異(P ＜0.05)。

圖1 免疫組織化學(xué)染色顯示梓醇對(duì)慢性腦缺血大鼠胼胝體少突膠質(zhì)細(xì)胞的影響

2.2 梓醇緩解腦白質(zhì)髓鞘損傷

LFB 髓鞘染色和MBP 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見(jiàn)圖2。在Sha 組中，LFB 染色和MBP 染色深、邊界清晰明顯。腦缺血損傷后，髓鞘稀疏，LFB 和MBP 染色變淺，兩者的平均光密度值顯著下降(與 Sha 組比較，P ＜0.01)。梓醇治療后，LFB 和 MBP 染 色的平均光密度值明顯升高(與 Veh 組比較，P ＜0.05)。

圖2 LFB 和免疫組織化學(xué)染色顯示梓醇對(duì)慢性腦缺血大鼠胼胝體髓鞘的影響

2.3 梓醇上調(diào)腦白質(zhì)p-Akt 表達(dá)

p-Akt 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見(jiàn)圖3。在Sha 組胼胝體中，p-Akt 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少。缺血損傷后，p-Akt 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)有少量增加，但與Sha 組比較無(wú)明顯差異。梓醇治療后，p-Akt 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加，與Veh 組比較，差異顯著(P ＜0.01)。免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果進(jìn)一步顯示梓醇可明顯增加胼胝體APC 和p-Akt雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，即梓醇促進(jìn)p-Akt 在少突膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)(與Veh 組比較，P ＜0.01)。

圖3 免疫組織化學(xué)染色顯示梓醇對(duì)慢性腦缺血大鼠胼胝體p-Akt 表達(dá)的影響

3 討論

人類腦白質(zhì)約占全腦組織的50%，輕度缺血即可造成腦白質(zhì)損傷［6］。胼胝體作為腦白質(zhì)的易損區(qū)域之一，在缺血后可通過(guò)損傷的神經(jīng)纖維破壞白質(zhì)與灰質(zhì)之間的信號(hào)傳遞，造成全腦性的神經(jīng)功能障礙［7］。在慢性腦缺血中，腦白質(zhì)可由于少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡、髓鞘脫失及神經(jīng)纖維斷裂，最終導(dǎo)致腦白質(zhì)的疏松和空泡樣病變［8］。少突膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成細(xì)胞，對(duì)體內(nèi)外缺血損傷極其敏感，慢性、輕微、持續(xù)性腦缺血時(shí)少突膠質(zhì)細(xì)胞較神經(jīng)元更易受損［9］。少突膠質(zhì)細(xì)胞受損或凋亡則可造成髓鞘的損傷，最終影響神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)。因此，少突膠質(zhì)細(xì)胞損害作為缺血時(shí)腦白質(zhì)損傷的重要原因，正在受到更多的關(guān)注［10］。在本研究中，利用APC 和MBP 免疫組織化學(xué)染色及LFB 染色法檢測(cè)腦白質(zhì)的損傷情況，發(fā)現(xiàn)慢性腦缺血可誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和髓鞘損傷，梓醇治療后則可明顯抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和髓鞘損傷，這說(shuō)明梓醇對(duì)腦白質(zhì)的保護(hù)作用與其抗凋亡效應(yīng)有關(guān)。

caspase-3 是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最重要的一種半胱氨酸蛋白酶，受凋亡刺激因素作用后被激活，活化的caspase-3 可通過(guò)裂解其底物，直接激活其他的蛋白酶如caspase-2 和caspase-9，或誘導(dǎo)線粒體功能障礙等多條途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡［11］。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)腦室內(nèi)注射caspase-3 抑制劑可獲得對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用［12］，這說(shuō)明 caspase-3 的激活與腦缺血損 傷有關(guān)［13-14］。Walker 等［15］研究發(fā)現(xiàn)缺血缺氧可誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)caspase-3 的激活，參與少突膠質(zhì)細(xì)胞的缺血性損傷。Han 等［12］也報(bào)道了 caspase-3 激活對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，抑制caspase-3 活性可促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的存活。本研究結(jié)果顯示梓醇可明顯抑制慢性腦缺血誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)caspase-3 表達(dá)的增多，這提示梓醇可通過(guò)降低caspase-3 的活性來(lái)抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt 被磷酯酰肌醇3 激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)磷酸化激活后，可通過(guò)不同途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活和凋亡?；罨腁kt(即p-Akt)一方面通過(guò)磷酸化一系列凋亡調(diào)控蛋白，如Bad、caspase-3 等，使這些促凋亡蛋白失活;另一方面通過(guò)促進(jìn)抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的存活，如p-Akt 使CREB 磷酸化后，激活 CREB 的轉(zhuǎn)錄功能，使Bcl-2、Bcl-xL 表達(dá)增強(qiáng)，穩(wěn)定線粒體的功能狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞存活［16］。在腦缺血損傷中，p-Akt 除了對(duì)神經(jīng)元具有廣泛的保護(hù)作用外，對(duì)于少突膠質(zhì)細(xì)胞的存活也具有重要的調(diào)節(jié)作用，如Pang 等［17］發(fā)現(xiàn)p-Akt可明顯抑制TNF-α 介導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷，促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞存活。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，梓醇治療可明顯提高p-Akt 在少突膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。這提示梓醇在慢性腦缺血中對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用可能與Akt 通路的激活有關(guān)。

綜上所述，梓醇可明顯抑制慢性腦缺血誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和髓鞘損傷，梓醇對(duì)腦白質(zhì)的保護(hù)作用與其上調(diào)p-Akt 的表達(dá)相關(guān)。本研究結(jié)果為臨床治療腦缺血損傷提供了新的研究思路和候選藥物。

［1］Farkas E，Donka G，de Vos RA，et al.Experimental cerebral hypoperfusion induces white matter injury and microglial activation in the rat brain［J］.Acta Neuropathol，2004，108(1):57 -64.

［2］Duan W，Gui L，Zhou ZJ，et al.Adenosine A2A receptor deficiency exacerbates white matter lesions and cognitive deficits induced by chronic cerebral hypoperfusion in mice［J］.J Neurol Sci，2009，285(1 -2):39-45.

［3］Li YC，Bao YM，Jiang B，et al.Catalpol protects primary cultured astrocytes from in vitro ischemia-induced damage［J］.Int J Devl Neurosci，2008，26(3 -4):309 -317.

［4］Zhu HF，Wan D，Luo Y，et al.Catalpol increases brain angiogenesis and up-regulates VEGF and EPO in the rat after permanent middle cerebral artery occlusion［J］.Int J Biol Sci，2010，6(5):443 -453.

［5］Hu LG，Sun YK，Hu J.Catalpol inhibits apoptosis in hydrogen peroxideinduced endothelium by activating the PI3K/Akt signaling pathway and modulating expression of Bcl-2 and Bax［J］.Eur J Pharmacol，2010，628(1 -3):155 -163.

［6］Dewar D，Underhill SM，Goldberg MP.Oligodendrocytes and ischemic brain injury［J］.J Cerebr Blood F Met，2003，23(3):263 -274.

［7］Chida Y，Kokubo Y，Sato S，et al.The alterations of oligodendrocyte，myelin in corpus callosum，and cognitive dysfunction following chronic cerebral ischemia in rats［J］.Brain Res，2011，1414(26):22 -31.

［8］Chen YZ，Yi Q，Liu G，et al.Cerebral white matter injury and damage to myelin sheath following whole-brain ischemia［J］.Brain Res，2013，1495(13):11 -17.

［9］Mciver SR，Muccigrosso M，Gonzales ER，et al.Oligodendrocyte degeneration and recovery after focal cerebral ischemia［J］.Neuroscience，2010，169(3):1364 -1375.

［10］Basile AM，Pantoni L，Pracucci G，et al.Age，hypertension，and lacunar stroke are the major determinants of the severity of age-related white matter changes［J］.Cerebrovasc Dis，2006，21(5 -6):315 -322.

［11］Sugawara T，Lewen A，Noshita N，et al.Effect of global ischemia duration on neuronal，astroglial，oligoden droglial，and microglial reactions in the vulnerable hippocampal CA1 subregion in rats［J］.J Neurotrauma，2002，19(1):85 -98.

［12］Han BH，Xu D，Choi J，et al.Selective，reversible caspase-3 inhibitor is neuroprotective and reveals distinct pathways of cell death after neonatal hypoxic-ischemic brain injury［J］.J Biol Chem，2002，277(33):30128 -30136.

［13］Rothstein RP，Levison SW.Gray matter oligodendrocyte progenitors and neurons die caspase-3 mediated deaths subsequent to mild perinatal hypoxic/ischemic insults［J］.Dev Neurosci，2005，27(2 -4):149 -159.

［14］Cao Y，Gunn AJ，Bennet L，et al.Insulin-like growth factor (IGF)-1 suppresses oligodendrocyte caspase-3 activation and increases glial proliferation after ischemia in near-term fetal sheep［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2003，23(6):739 -747.

［15］Walker EJ，Rosenberg GA.Divergent role for MMP-2 in myelin breakdown and oligodendrocyte death following transient global ischemia［J］.J Neurosci Res，2010，88(4):764 -773.

［16］Badr G，Saad H，Waly H，et al.Type I interferon(IFN-α/β)rescues B-lymphocytes from apoptosis via PI3Kδ/Akt，Rho-A，NFκB and Bcl-2/Bcl(XL)［J］.Cell Immunol，2010，263(1):31 -40.

［17］Pang Y，Zheng BY，F(xiàn)an LW，et al.IGF-1 protects oligodendrocyte progenitors against TNFalpha-induced damage by activation of PI3K/Akt and interruption of the mitochondrial apoptotic pathway［J］.Glia，2007，55(11):1099 -1107.