添加不同碳源渥堆發(fā)酵普洱熟茶香氣成分的研究

高 力，劉通訊

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

普洱茶是以云南大葉曬青毛茶（Camellia sinensis（Linn.）var.assamica（Masters）Kitamura）為原料，經(jīng)濕熱和微生物一系列生化反應(yīng)形成的具有獨(dú)特陳香和多種保健功能的后發(fā)酵茶[1]。普洱的陳香品質(zhì)不僅影響著消費(fèi)者的選擇追求，也主導(dǎo)著其市場(chǎng)價(jià)格[2]。

研究表明普洱獨(dú)特的香味是在渥堆工序中，普洱內(nèi)質(zhì)成分在一定的濕熱、酶促、微生物作用形成的[3]。不同儲(chǔ)存年份[4]、不同的干燥方式[5]、外源酶處理[2]、接種有益微生物[6]對(duì)普洱的香氣成分都有很大的影響。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)添加外源碳源有助于提高普洱發(fā)酵過(guò)程中的霉菌數(shù)及多酚氧化酶活，縮短發(fā)酵周期。本文通過(guò)對(duì)添加木糖、蔗糖、果膠三種不同單糖、雙糖、多糖發(fā)酵出的成品茶，采用同時(shí)蒸餾萃取聯(lián)合氣質(zhì)聯(lián)用（SDE-GC-MS）法測(cè)定普洱茶香氣成分，探討其對(duì)普洱熟茶香氣上的影響。為添加外源碳源促進(jìn)普洱發(fā)酵，改善普洱品質(zhì)進(jìn)一步提供的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

渥堆原料 云南騰沖大葉六級(jí)曬青毛茶，2012年；木糖、蔗糖、果膠 純度＞99%，上海博奧生物科技有限公司。

Trace DSQⅡGC/MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo fisher公司產(chǎn)品；HP-5彈性石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm，0.25μm） 美國(guó)安捷倫科技公司；ESJ200-4電子分析天平 上海精科電子有限公司；氮吹儀；同時(shí)蒸餾萃取器；電熱套；水浴鍋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料準(zhǔn)備 空白樣、添加木糖、蔗糖、果膠（添加比例為0.4%wt）樣在實(shí)驗(yàn)室渥堆發(fā)酵24d后自然晾干所得，發(fā)酵方法參考馮超浩等[7]的方法。發(fā)酵時(shí)間為2012年11～12月，香氣測(cè)定時(shí)間為2013年1月。

1.2.2 SDE提取方法 稱取普洱茶粉狀樣50g置于1000m L圓底燒瓶，加入200m L去離子水，另取二氯甲烷30m L置于250m L單頸圓底燒瓶中，兩燒瓶分別接在同時(shí)蒸餾-萃取裝置兩端，用電熱套加熱，兩邊達(dá)到平衡回流穩(wěn)定后，萃取2h，萃取液用無(wú)水硫酸鈉脫水干燥后過(guò)濾，氮吹儀揮發(fā)溶劑，濃縮得1m L淡黃色透明液體，過(guò)0.45μm膜，用氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 GC-MS條件 GC條件：采用HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度為220℃；載氣為He，純度＞99.999%，流速1.0m L/min；進(jìn)樣口溫度250℃，固相微萃取進(jìn)樣脫附5m in。程序升溫：50℃保持3m in，以2℃/m in升至125℃，保持5m in，以6℃/m in升至180℃，保持3m in，以15℃/m in升至250℃。

MS條件：轟擊電子能量：70eV，電子源電離方式：EI，離子源溫度：200℃，進(jìn)樣量：1μL，掃描范圍：29～550amu，掃描方式：全掃描。

1.3 GC-MS分析

由GC-MS得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用W iley及NIST兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行串聯(lián)檢索，并與文獻(xiàn)值對(duì)照相結(jié)合進(jìn)行人工解析。以各香氣組分的峰面積占香氣總峰面積之比值表示組分相對(duì)含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 添加不同碳源發(fā)酵的普洱茶的香氣組成

空白組和添加不同碳源發(fā)酵的普洱茶的CG-MS圖譜解析結(jié)果如圖1所示。因烷烴類對(duì)香氣的貢獻(xiàn)微弱，故將其略去[8]。由表1可以看到，共檢測(cè)出103種香氣成分，按照香氣物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分，有17種醇類、22種醛類、23種酮類、8種酯類、9種雜環(huán)化合物、9種碳?xì)漕惢衔铩?1種苯環(huán)化合物和4種甲氧基苯化合物。蔗糖組檢出的香氣成分最多有76種、空白組最少為66種。木糖組、果膠組均檢出72種。由表1和圖1可知，雖然各組分檢出香氣數(shù)量差不多，但成分差異較為明顯。從香氣類型看，果膠組主要以醛、酮、烯烴為主，其他各組均以醛、酮、醇類為主。添加碳源的各組醛類、酮類、雜環(huán)化合物均高于空白組，木糖組醛類、酮類化合物最多，蔗糖組雜環(huán)化合物最多有3.75%。蔗糖組的芳環(huán)化合物最多，有9.2%，果膠組烯烴類含量明顯高于其他各組，為19.12%。四個(gè)組分的甲氧基苯類總量均較少，在1.23%～4.16%之間。

續(xù)表

續(xù)表

2.2 醇類化合物

由表1可知，空白組、木糖組、蔗糖組和果膠組分別檢出13、11、14、11種醇類，且空白組醇類含量最多。各組芳樟醇、芳樟醇氧化物Ⅱ、α-杜松醇、雪松醇、α-松油醇等萜稀類化合物含量均較高，其中空白組最為顯著，有6.77%、3.68%、1.45%、2.63%、3.29%。木糖組萜稀醇類含量最豐富。已知芳樟醇等單萜醇類是在酶的作用下通過(guò)水解香氣前體物質(zhì)配糖體而生成[9]。所以這種差異可能來(lái)自于添加碳源后普洱發(fā)酵過(guò)程中的酶系變化。與木糖和果膠組相比，蔗糖組還含有2.11%橙花叔醇、0.22%羽扇豆醇、0.44%桃金娘烯醇、0.67%薄荷醇，類別更豐富。構(gòu)成醇類組要成分的這些單萜醇（芳樟醇、芳樟醇氧化物Ⅱ、香葉基芳樟醇、橙花叔醇）及倍半萜醇（杜松醇、雪松醇）等大都帶有濃郁的甜香、花香和木香[6]。

2.3 醛、酮、酯、雜環(huán)化合物和苯環(huán)化合物

醛的閾值一般很低，對(duì)茶葉香氣貢獻(xiàn)較大。有脂肪香和甜味，其來(lái)源于脂質(zhì)的降解，也有一些來(lái)自還原糖和氨基酸的Maillard反應(yīng)[10]。木糖組的醛類化合物含量最多（37.00%），空白組最少（26.16%），蔗糖組檢出的醛類最豐富有17種，空白最少有12種。各組中含量較豐富的幾種醛類為5-甲基呋喃醛（焦糖香、咖啡香和辛香）、己醛（清香）、十六醛（花和蠟香）、苯甲醛（杏仁香）、苯乙醛（花香）、天然壬醛（果香）。

圖1 不同處理后的普洱茶香氣組成圖Fig.1 Aroma compositions of Pu-erh tea with different treatment

圖2 不同處理渥堆過(guò)程堆溫變化Fig.2 Pile temperature of Pu-erh tea with different treatment

木糖組和蔗糖組的酮類含量最高，分別為24.06%、26.12%，其中5-甲基-2-（1-甲基乙基）-2-環(huán)己烯-1-酮在各組中含量均較高，在4.78%～6.87%之間，它與異福爾酮結(jié)構(gòu)相似，具有樟腦和薄荷香。植酮（青葉香氣和果香味）、茶香酮（甜木香）、異福爾酮（薄荷和樟腦香），這些典型的香味酮含量也較為顯著。木糖組和蔗糖組β-紫羅蘭酮（紫羅蘭花香）含量較高，分別為3.01%、2.26%，而在空白組和果膠組中未檢測(cè)到，已知β-紫羅酮為類胡蘿卜素的氧化降解過(guò)程產(chǎn)生的初級(jí)氧化產(chǎn)物，還可進(jìn)一步氧化為酯、酮類物質(zhì)[11]，其氧化程度不同造成各組有差異。蔗糖組還檢測(cè)出0.41%優(yōu)香芹酮（留蘭香型），果膠組檢測(cè)出0.22%法尼基丙酮（果香味）。

表1中雜環(huán)化合物均為含氧、氮雜環(huán)化合物，這類化合物有烘炒香，雖相比于醛、酮類含量較少，但貢獻(xiàn)很大，是影響普洱陳香的一類重要香氣[12]。添加碳源的各組雜環(huán)化合物含量均高于空白組，蔗糖組、果膠組含量最高，分別為5.32%、5.42%，主要有2-乙酰基呋喃、吡咯、2，6-二甲基吡嗪、4a，5，6，7，8a-六氫化-2，3，5，5，8a-五甲基-4氫-苯并吡喃和吲哚。其中吲哚作為普洱茶陳香成分在很低的含量下具有很強(qiáng)的花香味[13]。

各組檢出的酯類不多，且含量較少。直鏈酯類居多，具有代表性的是二氫獼猴桃內(nèi)酯（果香）、鄰苯二甲酸異丁基酯?？瞻捉M和添加碳源各組都檢出了多種苯環(huán)化合物，空白組主要有3.17%甘菊藍(lán)、1.24%甲苯、1.01%苯酚，木糖組主要有1.25%菲、1.03%甘菊藍(lán)和0.9%1，2，3，4-四氫化-甲基-8-（1-甲基乙基）-萘、蔗糖組主要有3.68%苯酚、2.40%甘菊藍(lán)、1.65%甲苯，而果膠組主要有1.19%甲苯、1.13%菲和0.67% 1，2，3，4-四氫化-甲基-8-（1-甲基乙基）-萘。

比較空白組和添加碳源的各組可看出，空白組檢測(cè)出的香氣組分中，其醛、酮、雜環(huán)化合物的數(shù)量和含量均少于添加碳源各組，特別是雜環(huán)化合物的含量，這可能是添加碳源后促進(jìn)了茶葉中氨基酸與糖類物質(zhì)發(fā)生Maillard反應(yīng)。原利男等[14]通過(guò)葡萄糖和氨基酸加熱進(jìn)行茶葉烘干模擬實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)生了呋喃、吡咯、吡嗪、苯酚及這幾種成分的甲基、乙基、羥基、醛基、乙酰基衍生物和乙酸等。倪德江[15]認(rèn)為水分和溫度是影響糖氨化合物形成的主要因子，在一定溫度下，高溫促進(jìn)糖氨化合物的形成，過(guò)高溫度將降糖胺化合物。任洪濤等[16]實(shí)驗(yàn)表明芳香族化合物的含量隨發(fā)酵程度的不斷加深而發(fā)生很大變化，發(fā)酵過(guò)度的普洱茶其主要的芳香族化合物的相對(duì)百分含量是適度發(fā)酵的近4倍。說(shuō)明溫度和發(fā)酵程度對(duì)普洱的香氣成分影響很大，各組普洱渥堆發(fā)酵溫度如圖2所示，相比空白組，添加碳源各組的渥堆溫度較高，蔗糖組在發(fā)酵過(guò)程中的平均堆溫最高，其次是果膠。良好的渥堆溫度，為Maillard反應(yīng)提供了很好的條件，促進(jìn)了醛、酮和雜環(huán)化合物的生成，同時(shí)，渥堆溫度不同，造成了各組的發(fā)酵程度不一樣。

2.4 烯烴化合物

由表1可知，各組共檢測(cè)除了9種烯烴化合物，空白組、木糖組、蔗糖組和果膠組分別檢出5、5、3、6種。主要是環(huán)蒜頭稀、雪松稀、杜松稀等半倍萜稀，其中各組分的環(huán)蒜頭稀都非常豐富，果膠組尤為顯著，達(dá)14.16%。這與張靈枝等[5]的發(fā)現(xiàn)相同。Buttery R G[17]、Mariotti J P等[18]分別在玉米葉和巖薔薇中檢測(cè)出了此種香氣成分，前者發(fā)現(xiàn)這種微量的香氣成分雖然很少，但其獨(dú)特的香味對(duì)小昆蟲(chóng)類具有吸引作用。雪松稀、杜松稀也是常見(jiàn)的普洱茶陳香的提供者[19]。果膠組中還有其他各組沒(méi)有的右旋檸檬稀和長(zhǎng)葉松萜稀。

2.5 甲氧基苯類化合物

與張靈枝等[5]研究相似，各組檢出的甲氧基苯類化合物相對(duì)較少。這可能與實(shí)驗(yàn)所用普洱茶陳放的時(shí)間有關(guān)。1，2，3-三甲氧基苯和3，4，5-三甲氧基甲苯除蔗糖組中的含量分別在2.06%、1.39%，其他各組這兩種成分在1.0%、0.5%左右。空白組和蔗糖組還檢測(cè)出了丁香子酚（4-烯丙基-2-甲氧基苯酚），木糖組有少量異丁香子酚。川上美智子[20]研究認(rèn)為，甲氧基苯類化合物的生成，是由于普洱茶中的EGCG在氧化降解過(guò)程中脫沒(méi)食子?；纬蓻](méi)食子酸，沒(méi)食子酸的羥基（-OH）的氫被（-CH3）取代，實(shí)現(xiàn)甲基化而產(chǎn)生甲氧基苯的類似結(jié)構(gòu)化合物，整個(gè)過(guò)程由微生物催化完成。添加碳源后，提高了渥堆溫度，改變了發(fā)酵過(guò)程微生物生長(zhǎng)環(huán)境，也可能改變了EGCG的氧化速度和氧化途徑，進(jìn)而影響甲氧基苯化合物的形成。

3 結(jié)論

添加外源碳源進(jìn)行發(fā)酵，提高了普洱發(fā)酵過(guò)程的平均渥堆溫度，促進(jìn)了Maillard反應(yīng)，從而豐富了香氣種類，增加了醛、酮、呋喃、吡啶等化合物的形成。

各組分之間的主要幾種香氣成分差異不大，但其他微量香氣成分差異明顯。各組含量較高的幾種香氣成分為5-甲基呋喃醛、芳樟醇、5-甲基-2-（1-甲基乙基）-2-環(huán)己烯-1-酮、環(huán)蒜頭稀。蔗糖組有多種其他組沒(méi)有的成分，如羽扇豆醇、桃金稀醇、天然葵醛、優(yōu)香芹酮等。木糖組的醛類含量最多，果膠組的烯烴種類最多。普洱中的香氣種類繁多，其香氣是多種成分共同作用的結(jié)果，添加不同碳源發(fā)酵的普洱茶中香氣組成、比例不同，其香氣表現(xiàn)各具特色。

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