山梨酸苯丙氨酸乙酯的合成及抑菌活性

曾廣翔，陸惠邦，孫勝玲，寧正祥，蘇 蘭，韋慶益，*

（1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510641；2.中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所，同位素地球化學(xué)國家重點實驗室，廣東廣州510640）

食品是人類賴以生存的基本物質(zhì)，它提供給人類生活所需要的各種營養(yǎng)素和能量。通過消耗食品中的營養(yǎng)物質(zhì)，細菌、酵母和真菌等可以迅速繁殖，從而導(dǎo)致食品發(fā)生微生物感染[1]。隨著生活水平的提高，人們越來越注重食品的質(zhì)量問題。因此，增強食品的安全性是十分有必要的。利用合成的化學(xué)食品防腐劑來控制微生物的生長以及防止食品腐敗，是最常用的方法之一[2]。目前，國內(nèi)常用的食品防腐劑按成分和來源不同，主要分為酯型防腐劑、酸性防腐劑、生物防腐劑和無機防腐劑四類[3-4]。食品防腐劑的構(gòu)效研究表明：α、β-不飽和羰基結(jié)構(gòu)是食品防腐劑具有抗菌活性的有效功能性結(jié)構(gòu)之一[5]。本文以山梨酸、苯丙氨酸和丙醇為原料，通過酰氯的方法對山梨酸進行改性，合成具有廣譜抑菌作用的化合物山梨酸苯丙氨酸丙酯。此藥物有望作為新型的食品防腐劑，也有望應(yīng)用于化妝品、皮具、木材等領(lǐng)域的防霉抗菌，具有廣泛的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

山梨酸 化學(xué)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；L-苯丙氨酸 含量≥98.0%，上海伯奧生物科技有限公司；乙醇 分析純，上海市凌峰化學(xué)試劑有限公司；氯化亞砜 分析純，天津市光復(fù)精細化工研究所；氫氧化鈉、石油醚（Ⅰ）、氯化鈉、蔗糖、無水葡萄糖 分析純，廣州化學(xué)試劑廠；乙酸乙酯 分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；硅膠粉 100～200目，上海誼恒工貿(mào)有限公司；牛肉膏、瓊脂粉 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；馬鈴薯 市售；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 用于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、牛奶酸敗混合菌的培養(yǎng)；馬鈴薯培養(yǎng)基 用于釀酒酵母和黑曲霉的培養(yǎng)[6]；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtili）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、牛奶酸敗混合菌、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑曲霉（Aspergillus niger） 由華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院提供。

AvanceIII 400核磁共振儀 瑞士布魯克公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市英浴高科儀器廠；RE-S2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；S20型實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；YX-18LD型手提式壓力蒸汽滅菌鍋 江門濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；THZ-82A型水浴恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司；721G型可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SPX-100B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司設(shè)備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 山梨酸苯丙氨酸乙酯的合成 苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽的合成：向裝有低溫溫度計的100m L三口燒瓶中加入無水乙醇30m L。向其中加入一定比例的苯丙氨酸和氯化亞砜，冰鹽浴中反應(yīng)1h，再加熱回流，直至固體完全消失。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去剩余的乙醇及SOCl2，得到中間體苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽[7-9]。

山梨酸的酰氯化反應(yīng)：向100m L圓底燒瓶中加入摩爾比為1∶3的山梨酸和氯化亞砜，在常溫下攪拌反應(yīng)1h。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去剩余的SOCl2，得到酰氯化后的山梨酸。

山梨酸苯丙氨酸乙酯的合成：向100m L圓底燒瓶中加入摩爾比為1∶1的苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽和酰氯化后的山梨酸，冰鹽浴反應(yīng)3h，室溫反應(yīng)4h。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去低沸點物質(zhì)，得到山梨酸苯丙氨酸乙酯粗品（圖1）。合成山梨酸苯丙氨酸乙酯反應(yīng)式如下：

圖1 山梨酸苯丙氨酸乙酯反應(yīng)式Fig.1 Synthesis of ethyl N-[1-oxo-2，4-hexadien-1-yl]-L-phenylalaninate

1.2.2 苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽工藝參數(shù)優(yōu)化實驗

1.2.2.1 單因素實驗 固定苯丙氨酸與氯化亞砜摩爾比1∶3，反應(yīng)溫度60℃，考察反應(yīng)時間分別為2、3、4、5、6h時對苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的影響。固定苯丙氨酸與氯化亞砜摩爾比1∶3，反應(yīng)時間4h，考察反應(yīng)溫度分別為50、60、70、80、90℃時對苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的影響。固定反應(yīng)時間4h，反應(yīng)溫度60℃，考察苯丙氨酸與氯化亞砜摩爾比分別為1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0、1∶3.5和1∶4.0時對苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的影響。

1.2.2.2 正交實驗 為了優(yōu)化反應(yīng)條件和提高反應(yīng)收率，在單因素條件實驗的基礎(chǔ)上，以苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽的收率為考察指標(biāo)，選擇反應(yīng)時間（A）、反應(yīng)溫度（B）和物料配比（C）為考察因素，以收率為考察指標(biāo)，進行正交實驗，其正交實驗因素與水平見表1。

表1 正交實驗因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.3 苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的計算 公式如下：

1.2.4 產(chǎn)物的分離純化 用乙酸乙酯對合成產(chǎn)物進行萃取，再用濃度為20g/L的NaOH溶液進行洗滌初步純化，最后經(jīng)層析柱（固定相為硅膠粉，流動相為石油醚∶乙酸乙酯=2∶1）進一步純化后，得到純品山梨酸苯丙氨酸乙酯。

1.2.5 最低抑菌濃度（M IC）測定 最低抑菌濃度的測定采用平板涂布法：將不同濃度的防腐劑溶液加入到已經(jīng)滅菌的培養(yǎng)皿中，然后加入一定體積的培養(yǎng)基，充分混合以達到所需要的濃度。待培養(yǎng)基冷卻后，加入等量的菌懸液0.1m L，用涂布器涂布均勻，置于37℃（細菌）培養(yǎng)24h；28℃（酵母）培養(yǎng)48h；28℃培養(yǎng)72h（霉菌）。觀察菌體的生長情況，從無菌生長的培養(yǎng)皿中找出最低藥物濃度的培養(yǎng)皿，此皿的藥物濃度即為該藥物的最低抑菌濃度[10-11]。

1.2.6 微生物生長曲線測定 采用比濁法，100m L無菌營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，接入0.5m L牛奶酸敗混合菌菌液，37℃恒溫培養(yǎng)，測定不同培養(yǎng)時間樣品在560nm波長下的吸光值A(chǔ)560。以時間為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)560為縱坐標(biāo)，繪制微生物生長曲線[12-13]。抑菌率按下式計算：

式中：△t，k和△t，i分別為空白與樣品在t時刻A560與接種時（t=0）A560相比的增量[14]。

1.2.7 核磁共振 以四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)物，其化學(xué)位移值為0，以氘代氯仿為溶劑，測定樣品的1H核磁共振譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 反應(yīng)時間對苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的影響

由圖2可知，當(dāng)反應(yīng)時間為2h時，苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽的收率只有40.7%。隨著反應(yīng)時間的增加，苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽的收率也相應(yīng)增大。當(dāng)反應(yīng)時間為4h時，苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽的收率達到最高，為89.4%。而繼續(xù)增加反應(yīng)時間，苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽的收率略有下降，可能是由于時間過長導(dǎo)致副產(chǎn)物增多緣故。

圖2 反應(yīng)時間對苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的影響Fig.2 The effect of reaction time on the yeild of L-Phenylalanine ethyl ester hydrochloride

2.1.2 反應(yīng)溫度對苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的影響

由圖3可知，當(dāng)反應(yīng)溫度低于60℃時，苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率隨著反應(yīng)溫度的增加而增加；當(dāng)反應(yīng)溫度大于60℃時，苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率隨著反應(yīng)溫度的增加而略有降低，可能是由于溫度過高導(dǎo)致氯化亞砜不斷揮發(fā)，從而降低了氯化亞砜和乙醇分子碰撞的機會，進一步影響最終產(chǎn)率。

圖3 反應(yīng)溫度對苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的影響Fig.3 The effectof reaction temperature on the yield of L-Phenylalanine ethyl ester hydrochloride

圖4 物料配比對苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的影響Fig.4 The effectofmaterial ratio on the yield of L-Phenylalanine ethyl ester hydrochloride

2.1.3 苯丙氨酸與氯化亞砜的摩爾比對苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的影響 由圖4可知，當(dāng)苯丙氨酸與氯化亞砜的摩爾比為1∶3時，苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率較高。繼續(xù)增加氯化亞砜用量，苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率反而下降。這是因為氯化亞砜極易揮發(fā)，部分過量有利于反應(yīng)進行，但當(dāng)氯化亞砜的量增加到一定程度時，便加大了氯化亞砜雙鍵聚合的可能性，導(dǎo)致收率下降。

2.2 苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽正交實驗

苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽正交實驗結(jié)果如表2所示。從表2極差R的大小可以看出，影響苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽收率的因素大小依次為：B＞C＞A，即主次順序依次為：反應(yīng)溫度、物料配比、反應(yīng)時間。由k值可得合成苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽的工藝條件為A1B2C3，即反應(yīng)時間3.5h、反應(yīng)溫度60℃、苯丙氨酸與氯化亞砜的摩爾比1∶3.2。驗證實驗表明，此條件下苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽的收率為93.8%。

表2 正交實驗設(shè)計與結(jié)果Table2 Design and results of orthogonal test

2.3 產(chǎn)物表征

表3 山梨酸苯丙氨酸乙酯的1H NMR譜數(shù)據(jù)Table3 1H NMR data of ethyl N-[1-oxo-2，4-hexadien-1-yl]-L-phenylalaninate

產(chǎn)品為淺黃色固體，熔點69.8～72.2℃。其1H NMR譜數(shù)據(jù)如表3所示，1H NMR可提供化學(xué)位移、峰面積積分值、自旋分裂數(shù)和耦合常數(shù)幾方面的數(shù)據(jù)，根據(jù)這些數(shù)據(jù)可對產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進行鑒定。從表3可以看出，氫原子總數(shù)為21個，與山梨酸苯丙氨酸乙酯分子式的氫原子數(shù)一致。另外，H的化學(xué)位移值與氫原子所在官能團的位置呈一一對應(yīng)關(guān)系，其與山梨酸苯丙氨酸乙酯結(jié)構(gòu)式的氫原子位置一致。因此，可確定產(chǎn)物為山梨酸苯丙氨酸乙酯。

2.4 最低抑菌濃度測定

由表4可知，山梨酸苯丙氨酸乙酯對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和牛奶酸敗混合菌的最低抑菌濃度分別為2.50、0.75、2.00、2.50mmol/L，與山梨酸抑菌效果相當(dāng)，其中對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌效果優(yōu)于山梨酸。表明山梨酸苯丙氨酸乙酯對食品常見污染菌具有較強的抑菌活性。而山梨酸對釀酒酵母和黑曲霉的最低抑菌濃度分別為4.50mmol/L和4.00mmol/L，比山梨酸苯丙氨酸乙酯的抑菌效果要好。

表4 山梨酸苯丙氨酸乙酯對供試菌的最低抑菌濃度（mmol/L）Table4 Antimicrobial activity of ethyl N-[1-oxo-2，4-hexadien-1-yl]-L-phenylalaninate against the selected microorganisms determined as theminimal inhibitory concentration（MIC，inmmol/L）

2.5 山梨酸苯丙氨酸乙酯對牛奶酸敗混合菌的生長抑制作用

實驗中，山梨酸苯丙氨酸乙酯和山梨酸的添加量都為2.5mmol/L。由圖5可以看出，在pH等于7的中性條件下，空白對照組中牛奶酸敗混合菌快速生長繁殖，當(dāng)時間為12h時，菌液的OD560nm值便達到了0.984。而山梨酸和山梨酸苯丙氨酸乙酯的細菌生長適應(yīng)期均延長至了24h，抑菌率達到90%以上，表明山梨酸和山梨酸苯丙氨酸乙酯具有明顯的抑菌作用。在pH等于5的酸性條件下，山梨酸表現(xiàn)出較好的抑菌效果，其48h內(nèi)菌液的OD560nm值在0.1以下。山梨酸苯丙氨酸乙酯的抑菌效果則與在中性條件下的抑菌效果相當(dāng)，24h內(nèi)可顯著抑制細菌的生長。在pH等于9的堿性條件下，山梨酸苯丙氨酸乙酯依然具有較好的抑菌活性，使得牛奶酸敗混合菌的適應(yīng)期延長至36h。但山梨酸在pH等于9的堿性條件下，當(dāng)時間為18h，抑菌率在10%以下，表明其幾乎完全失去了抑菌活性。

綜上所述，山梨酸雖然具有較強的抑菌效果，但僅在酸性條件下得以發(fā)揮其作用。在中性條件下，山梨酸的抑菌效果則大大降低。而在堿性條件下，山梨酸幾乎沒有任何抑菌活性，可能是由于反應(yīng)生成鹽后改變了其性質(zhì)的緣故。山梨酸苯丙氨酸乙酯的抑菌效果受體系pH影響較小，在不同的pH條件下依然可以保持較強的抑菌活性。

3 結(jié)論

3.1 以山梨酸、苯丙氨酸和乙醇為原料，通過酰氯反應(yīng)，可以較高效率地合成山梨酸苯丙氨酸乙酯。合成苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽最佳工藝條件為：反應(yīng)時間3.5h，反應(yīng)溫度60℃，苯丙氨酸和氯化亞砜的摩爾比1∶3.2，此時收率可達93.8%。

圖5 山梨酸苯丙氨酸乙酯對牛奶酸敗混合菌的生長抑制作用Fig.5 The growth inhibition effect on themixed bacteria from ranciditymilk of ethyl N-[1-oxo-2，4-hexadien-1-yl]-L-phenylalaninate

3.2 山梨酸苯丙氨酸乙酯對腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和牛奶酸敗混合菌的最低抑菌濃度分別為2.50、0.75、2.00、2.50mmol/L，其抑菌效果要優(yōu)于防腐劑山梨酸。

3.3 山梨酸苯丙氨酸乙酯在不同的pH體系均具有較強的抑菌活性，有望作為新型防腐劑應(yīng)用于食品、化妝品領(lǐng)域。

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