扇貝多肽脂質(zhì)體制備工藝的優(yōu)化與表征

鄭 媛，紀(jì)曉峰，鄭蘭紅，盛 軍，王海英，孫 謐

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所海洋酶與酶工程實(shí)驗(yàn)室，山東青島266071）

以水產(chǎn)食品魚(yú)類、貝類為原料，利用其下腳料提取活性生物肽，可提升食品加工過(guò)程中廢棄物的再利用，產(chǎn)生更高的價(jià)值，滿足更多行業(yè)的需求，成為近年來(lái)人們研究的熱點(diǎn)[1-3]。扇貝多肽（polypeptide from Chlamys farreri，PCF）是來(lái)源于櫛孔扇貝的一種海洋抗氧化多肽（專利ZL200510000032.2），它分子量小（M r=794u），易溶于水，毒性低。已有研究表明，PCF具有清除羥自由基和超氧陰離子的能力，可以保護(hù)紫外線引起的細(xì)胞損傷[4-5]，這種顯著的抗氧化性能決定了其在日化領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景[6-8]。

PCF由于其易溶于水的特點(diǎn)，與酯類制劑配伍性差，且不易直接滲透到皮膚角質(zhì)層，限制了其作為日化添加劑的開(kāi)發(fā)。脂質(zhì)體作為一種新型載體，利用磷脂雙分子層包裹活性成分，直接傳遞至細(xì)胞深層，促進(jìn)吸收，減少刺激性，目前歐洲、美國(guó)和日本市場(chǎng)上有10%的護(hù)膚品和防曬品中應(yīng)用了脂質(zhì)體技術(shù)[9]。脂質(zhì)體的制備方法有很多種，如薄膜法[10-11]、反相蒸發(fā)法[12-13]、復(fù)乳法[14]、注入法[15-17]、梯度法[18]等，不同方法獲得脂質(zhì)體的包封率不同。本研究選用了pH梯度法，根據(jù)Handerson-Hasselbalch理論，產(chǎn)生內(nèi)外梯度差，使目的物跨膜加速聚集，因此包封率大大高于被動(dòng)載體，胰島素應(yīng)用此法獲得的脂質(zhì)體包封率可以由20%左右提高到50%[19]。

眾所周知，脂質(zhì)體作為藥物載體，應(yīng)用廣泛[20]，但用于化妝品以及食品工業(yè)中的報(bào)道相對(duì)較少[21-22]，是近年來(lái)才興起的研究領(lǐng)域。為保持多肽蛋白類藥物的生物活性和穩(wěn)定性，各種新型的、條件溫和的脂質(zhì)體制備方法應(yīng)用其中，取得了較好的效果[23]，但還沒(méi)有用于日化工業(yè)生物活性物質(zhì)脂質(zhì)體體系的構(gòu)建報(bào)道。本文研究了將其用于PCF化妝品制劑制備的可行性，探討了pH梯度法制備PCF脂質(zhì)體的條件，優(yōu)化獲得最佳工藝，并對(duì)獲得的脂質(zhì)體性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

扇貝多肽（polypeptide from Chlamys farreri，PCF） 系本實(shí)驗(yàn)室純化，方法見(jiàn)文獻(xiàn)[24]，純度＞95%；乙醚、磷酸氫二鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、吐溫80、卵磷脂（大豆）、膽固醇 均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 亞榮；JY96-ⅡN超聲破碎儀 新芝；Zetasizer Nano激光散射粒徑分析儀Malvern；JEM-200EX型電子顯徽鏡 TEM。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 pH梯度法制備PCF脂質(zhì)體工藝流程 稱取一定量的大豆卵磷脂、膽固醇和吐溫80→溶解于適量乙醚→置于圓底燒瓶，50℃恒溫減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉有機(jī)溶劑，使磷脂在蒸發(fā)瓶底形成一層薄膜→加入一定pH的0.3mol/L檸檬酸鹽溶液10mL→50℃水化30min→樣品4℃放置保存。

在空白脂質(zhì)溶液中加入PCF干粉混勻→飽和Na2HPO4溶液將pH調(diào)高3→超聲5min（間歇超聲，1s/1s）→靜置2h→使用0.45μm濾膜過(guò)濾→樣品4℃放置保存。

1.2.2 脂質(zhì)體包封率的測(cè)定

1.2.2.1 多肽定量 PCF的量由雙縮脲法確定[25]。

1.2.2.2 脂質(zhì)體分離方法 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，超濾法可用于脂質(zhì)體包封率的測(cè)定[26]。取PCF脂質(zhì)體5m L至Millipore超濾杯中超濾，使用1萬(wàn)分子量超濾膜截留脂質(zhì)體，收集濾出液，定容至適當(dāng)濃度，測(cè)定其中游離PCF總量。

1.2.2.3 包封率的計(jì)算 超濾法將脂質(zhì)體與游離PCF分離，測(cè)定游離PCF量，根據(jù)下式計(jì)算脂質(zhì)體包封率（EE）：EE（%）=（Ct-Cf）/Ct×100。式中，Cf是游離PCF含量，Ct是加入的總PCF含量。

1.2.3 脂質(zhì)體制備工藝優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 直接稱取卵磷脂200mg，溶解于乙醚后蒸干成膜，使用不同的檸檬酸鹽溶液（pH分別為1、2、3、4）水化后，用飽和Na2HPO4溶液調(diào)節(jié)pH增加3，確定pH梯度對(duì)脂質(zhì)體包埋效果的影響。稱取卵磷脂200mg制備空白脂質(zhì)，按照0.5～4mg/m L分別添加PCF，確定PCF最佳載量。固定卵磷脂量為200mg，改變膽固醇的加量（30～90mg）和吐溫80的加量（0～100mg），考察膽固醇和吐溫80的加入對(duì)脂質(zhì)體包封效果的影響。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels of experiment

1.2.3.2 復(fù)合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析 依次改變PCF脂質(zhì)體制備時(shí)PCF添加量、膽脂比（膽固醇/卵磷脂）以及吐溫80量，以包封率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。選擇三因素進(jìn)行復(fù)合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析，優(yōu)化其制備條件。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的水平及編碼表見(jiàn)表1。

1.2.4 脂質(zhì)體的粒徑和形態(tài) 吸取少量脂質(zhì)體懸液，稀釋至卵磷脂含量在0.025%（W/W），裝入小瓶，放入激光散射粒徑分析儀中進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 脂質(zhì)的穩(wěn)定性 將制備的PCF脂質(zhì)體分別置于室溫（25℃）和冷藏環(huán)境下（4～6℃），每隔一天測(cè)量其包封率。測(cè)試PCF脂質(zhì)體的溫度穩(wěn)定性，以初始制備的脂質(zhì)體包封率為100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素條件對(duì)PCF脂質(zhì)體制備的影響

2.1.1 pH梯度對(duì)脂質(zhì)體包埋效果的影響 PCF為水溶性多肽，常規(guī)方法制備脂質(zhì)體的包封率較低。pH梯度法通過(guò)形成內(nèi)外水相的不同H+梯度，使PCF向脂質(zhì)內(nèi)部主動(dòng)聚集，可以實(shí)現(xiàn)包封率的提高，且不易泄露。根據(jù)Henderson-Hasselbalch理論，脂質(zhì)體內(nèi)外pH梯度差為3個(gè)單位時(shí)，理論上就會(huì)造成內(nèi)外濃度的1000倍之差[27]。研究了不同pH梯度條件下，脂質(zhì)包封率的影響，發(fā)現(xiàn)pH 4～7和pH 3～6梯度的包封率都較高，超過(guò)了85%，而其中pH 4～7梯度條件溫和，對(duì)于多肽是更為穩(wěn)定的環(huán)境，因而確定制備脂質(zhì)體的pH梯度范圍為pH4～7。

表2 pH梯度對(duì)包封率的影響Table2 Effectof pH gradienton encapsulation efficiency of liposome

2.1.2 PCF載量對(duì)脂質(zhì)體包埋效果的影響 制備空白脂質(zhì)，按照0.5～4mg/m L分別添加PCF。從圖1結(jié)果中可以看出，脂質(zhì)體對(duì)于PCF的包埋能力是有一個(gè)限度的，超過(guò)2mg/m L濃度后，包封率開(kāi)始下降，這與卵磷脂的濃度以及磷脂雙分子層的穩(wěn)定性有關(guān)。

圖1 PCF添加量對(duì)脂質(zhì)體包埋效果的影響Fig.1 Effectof PCF to phospholipids ratio on encapsulation efficiency of liposome

2.1.3 膽固醇對(duì)脂質(zhì)體包埋效果的影響 膽固醇可以調(diào)節(jié)磷脂雙分子層的流動(dòng)性，對(duì)包封率和脂質(zhì)體的穩(wěn)定性有重要影響。通過(guò)考察膽固醇/卵磷脂比對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響，結(jié)果如圖2所示。

隨著膽固醇添加量的增加，包封率先提高后降低，膽固醇在最初添加時(shí)，可以嵌入到磷脂膜中，與磷脂分子交替排列，可以增加膜的穩(wěn)定性，減少泄露。但是膽固醇的量如果過(guò)大，反而會(huì)干擾雙分子層的形成，使膜的流動(dòng)性增加，相變溫度變低，因此包封率也會(huì)隨之降低。當(dāng)卵磷脂量為200mg時(shí)，膽固醇的最適添加量為50mg，即膽脂比（膽固醇與卵磷脂質(zhì)量之比）為1∶4時(shí)，此時(shí)的包封率最高，可以達(dá)到90%左右。

圖2 膽固醇加量對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響Fig.2 Effectof cholesterol on encapsulation efficiency of liposome

2.1.4 吐溫80對(duì)脂質(zhì)體包埋效果的影響 吐溫80是常用的非離子型親水性表面活性劑，適當(dāng)?shù)奶砑油聹?0在脂質(zhì)體中，可以防止脂質(zhì)體懸液中的小脂粒聚集、融合和沉淀。通過(guò)考察不同濃度的吐溫80對(duì)形成PCF脂質(zhì)體的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 吐溫80對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響Fig.3 Effectof Tween 80 on encapsulation efficiency of liposome

結(jié)果表明，當(dāng)卵磷脂為200mg時(shí)，吐溫80添加60mg可以達(dá)到較好的包封效果。

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用pH梯度法制備PCF脂質(zhì)體，合適的梯度范圍是3～6或者4～7，考慮到蛋白多肽類的保存環(huán)境需要更溫和，選取了4～7的pH梯度。之后在制備時(shí)固定其他因素的量，優(yōu)化膽脂比為1∶4，吐溫80/卵磷脂為3∶10。膽固醇和吐溫80都與磷脂雙分子層小球的形成穩(wěn)定性有關(guān)系，配合PCF的載量變化，會(huì)顯著影響到包封率的高低。杜丹丹等制備石榴皮多酚脂質(zhì)體時(shí)，發(fā)現(xiàn)膽脂比和兩相體積比之間存在較為顯著的交互作用[28]；趙圣書(shū)等則在制備黑加侖花苷脂質(zhì)體時(shí)發(fā)現(xiàn)各個(gè)因素之間表現(xiàn)出一定的正負(fù)相關(guān)性[29]；這種現(xiàn)象還在其他脂質(zhì)體的制備過(guò)程中被發(fā)現(xiàn)[13-17]，因此，采用響應(yīng)面方法考察PCF脂質(zhì)體制備工藝中重要因素之間的作用可以進(jìn)一步理清其中的關(guān)系。

2.2 脂質(zhì)體制備工藝的復(fù)合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)包封率影響顯著的三個(gè)因素：PCF載量、膽固醇/卵磷脂以及吐溫80/卵磷脂，以包封率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)20組實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 中心復(fù)合設(shè)計(jì)以及包封率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table3 Central composite design and values of encapsulation efficiency

利用Minitab 15.0對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，獲得了以下多元回歸方程：

其中，Y為包封率，X1、X2、X3為PCF添加量、膽固醇與卵磷脂的加量比及吐溫80與卵磷脂的加量比的編碼值。方差分析表見(jiàn)表4和表5，由結(jié)果可見(jiàn)，該模型回歸顯著（p＜0.001），預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間有高相關(guān)性（R2=0.9236），說(shuō)明該模型擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可用此模型對(duì)PCF脂質(zhì)體制備工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)包封率影響的主次順序?yàn)椋篨2＞X3＞X1，模型中X、X、X項(xiàng)對(duì)包封率的影響也極顯著（p＜0.01），線性和平方回歸的擬合度較好。

多元二次回歸方程對(duì)應(yīng)的響應(yīng)曲線圖見(jiàn)圖4～圖6，各個(gè)因素及其之間相互的影響可以從圖上直接分析得到。從圖上可以對(duì)其響應(yīng)面曲線以及等高線圖進(jìn)行分析，直觀看出優(yōu)化區(qū)域，并可以在優(yōu)化區(qū)域內(nèi)根據(jù)脂質(zhì)體制備過(guò)程中的實(shí)際需要調(diào)整各因素的數(shù)值大小，從而得到包封率較高的脂質(zhì)體[29]。由圖4～圖6可知，曲面效應(yīng)比較顯著，PCF添加量、膽固醇與卵磷脂的加量比及吐溫80與卵磷脂的加量比之間存在著明顯協(xié)同作用，在一定范圍內(nèi)，同時(shí)增加才能提高脂質(zhì)體的包封率。響應(yīng)曲面的彎曲程度大，表明各響應(yīng)值對(duì)影響因素的改變頗為敏感。

表4 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table4 Significant regressionmodel coefficients test

圖4 膽脂比和載量影響脂質(zhì)體包封率的曲面圖Fig.4 Response surface plotof encapsulation efficiency between cholesterol/phospholipids ratio and PCF

由曲面圖4可知，在一定的范圍內(nèi)，隨著膽脂比的升高，包封率先增加后降低，說(shuō)明一定量的膽固醇可以調(diào)節(jié)磷脂膜的流動(dòng)性，有學(xué)者從電化學(xué)角度證明，含有膽固醇的磷脂雙層膜相對(duì)較為穩(wěn)定，不易形成孔洞或缺陷，是因?yàn)槟懝檀嫉膬尚蕴攸c(diǎn)對(duì)脂類的物理狀態(tài)有重要的調(diào)節(jié)作用，且這種作用與膽固醇的濃度有關(guān)[30-31]。隨著磷脂雙層膜穩(wěn)定性的改變，PCF的載量也隨之變化。

圖5 吐溫80/卵磷脂和PCF載量影響脂質(zhì)體包封率的曲面圖Fig.5 Response surface plotof encapsulation efficiency between Tween80/phospholipids ratio and PCF

由圖5可以看出，表面活性劑吐溫80與包封率之間也存在著影響關(guān)系，隨著吐溫80的加入，包封率也呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。吐溫80是一種非離子型表明活性劑，可以物理吸附到脂質(zhì)層表面，其親水集團(tuán)覆蓋在脂質(zhì)表面，增加了脂質(zhì)體小球的厚度。為了使這種覆蓋更加完全，吐溫80的濃度需要維持在一定數(shù)值，使其在溶液和脂質(zhì)層中的分配平衡[32]，本研究的結(jié)果也證明了這一特點(diǎn)。此外，PCF的載量也隨之發(fā)生了相應(yīng)的正相關(guān)變化。

圖6 吐溫80/卵磷脂和膽脂比影響脂質(zhì)體包封率的曲面圖Fig.6 Response surface plotofencapsulation efficiency between Tween80/phospholipids ratio and cholesterol/phospholipids ratio

表5 包封率在中心復(fù)合設(shè)計(jì)中回歸方程方差分析表Table5 ANOVA for the regression equation of encapsulation efficiency in Central composite design

由圖6可知，等高線的疏密程度以及陡度大于圖4和圖5，說(shuō)明膽脂比和吐溫80的共同改變對(duì)包封率的影響更為明顯。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的水平范圍內(nèi)，各個(gè)因素在中心水平附近都可以獲得最大的包封效果，充分說(shuō)明脂質(zhì)體的形成需要合適的膽脂比、吐溫80以及包裹量，過(guò)大濃度添加PCF、膽固醇和吐溫80不但不利于脂質(zhì)體的形成，反而會(huì)加速雙分子膜的破裂或聚合。

建立中心復(fù)合設(shè)計(jì)模型后，在模型范圍內(nèi)尋找最佳配方，得到的PCF添加量為2.15mg/m L，膽固醇與卵磷脂的加量比0.28，吐溫80與卵磷脂的加量比為0.34，獲得脂質(zhì)體包封率的預(yù)測(cè)值為96.76%?？紤]到實(shí)際操作的便利，采用卵磷脂為200mg，膽固醇加量為56mg，吐溫80加量為68mg，PCF添加量為2.15mg/m L，pH梯度為4～7，制備三批脂質(zhì)體樣品，平均包封率為96.05%，與預(yù)測(cè)值之間的偏差小于1%，說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化建立的模型與實(shí)際值能夠很好契合。

2.3 PCF脂質(zhì)體質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.1 粒徑分布及微觀形態(tài)觀察 按照上述配方和工藝制得PCF脂質(zhì)體，由馬爾文電位儀Nano-ZS90對(duì)所制脂質(zhì)體粒徑主要分布及電位進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，優(yōu)化工藝所得脂質(zhì)體的粒徑平均分布在200nm以下，符合透皮吸收的要求（圖7）。Zeta電位結(jié)果表明，抗氧化肽脂質(zhì)體帶負(fù)電荷，平均Zeta電位為-21.3mV，具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。透射電鏡觀察，PCF脂質(zhì)體為圓球形單室脂質(zhì)體，磷脂雙分子膜清晰可見(jiàn)（圖8）。

圖7 pH梯度法制備的PCF脂質(zhì)體的粒徑分布圖Fig.7 Particle size distribution of PCF liposomes prepared by pH gradientmethod

圖8 pH梯度法制備的PCF脂質(zhì)體的電鏡圖（50000×）Fig.8 Electronmicroscope imagine of PCF liposomes prepared by pH gradientmethod（50000×）

2.3.2 脂質(zhì)體的穩(wěn)定性 從圖9可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，PCF脂質(zhì)體的包封率總體有下降的趨勢(shì)，尤其是在25℃接近室溫的條件下，脂質(zhì)體存放30d后，包封率只有最初的81.7%。長(zhǎng)期存放后的脂質(zhì)體局部會(huì)形成較大的膜塊，在貯存過(guò)程中，脂質(zhì)體會(huì)發(fā)生絮凝，所包容的活性成分也會(huì)逐漸泄漏，但低溫環(huán)境可以延緩這一變化，從圖9可以看出，4～6℃條件下保存的脂質(zhì)體包封率的衰減得到明顯控制，同樣在30d后，包封率還能超過(guò)最初包封率的95%以上，說(shuō)明冷藏條件對(duì)于PCF脂質(zhì)體的保存非常有利?？傮w上來(lái)看，使用pH梯度法制備的PCF脂質(zhì)體穩(wěn)定性較為良好，即使在室溫條件下保存一個(gè)月包封率也保持在80%以上。

圖9 溫度及存放時(shí)間與包封率的關(guān)系Fig.9 The relationship between temperature and time

3 結(jié)論

梯度-超濾法制備扇貝多肽PCF脂質(zhì)體，通過(guò)單因素篩選和中心復(fù)合設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析方法優(yōu)化了制備方法，以提高脂質(zhì)體的包封率及穩(wěn)定性。研究了PCF脂質(zhì)體制備過(guò)程中的三個(gè)重要因素：PCF載量、膽脂比和吐溫80加量，以包封率為響應(yīng)值擬合出回歸模型，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，能較好契合脂質(zhì)體實(shí)際制備工藝中的參數(shù)。最終確定了pH梯度法制備脂質(zhì)體工藝和配方：卵磷脂為200mg，膽固醇加量為56mg，吐溫80加量為68mg，PCF添加量為2.15mg/m L，pH梯度為4～7，包封率最高能達(dá)到96.05%。PCF脂質(zhì)體為圓球形單室脂質(zhì)體，粒徑小于200nm，符合透皮吸收的要求，在4～6℃具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

與已經(jīng)報(bào)道的pH梯度法制備水溶性物質(zhì)脂質(zhì)體相比[27，33-34]，進(jìn)行PCF包裹得到的包封率更高，能達(dá)到90%以上，說(shuō)明PCF很適合使用這種包裹工藝。但是PCF的載量相對(duì)較小，超過(guò)2mg/m L左右的量包封率就開(kāi)始大幅下降，還難以滿足實(shí)際應(yīng)用的需要，因此仍需在提高PCF載量方面進(jìn)一步探討。

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