響應(yīng)面法優(yōu)化棗核總黃酮超聲提取工藝研究

陳 蘭，李喜宏，王騰月，郝梅梅，馬 文

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

我國(guó)大棗資源豐富，年產(chǎn)量可達(dá)300多萬(wàn)t，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值極高，被譽(yù)為“木本糧食，滋補(bǔ)佳品”。目前，大棗產(chǎn)品多種多樣，如蜜棗、棗泥、棗脯、棗酒等，而其加工和食用后的棗核下腳料則被丟棄或燒掉?！侗静菥V目》中記載：“核，燒、研，慘脛瘡良”，可見，棗核具有一定的藥用價(jià)值，若被丟棄或燃燒，在一定程度上污染了環(huán)境，并造成資源的浪費(fèi)。研究表明，棗核中有較多的總黃酮物質(zhì)，并且具有預(yù)防心腦血管疾病、防癌抗癌的功效[1-2]。以棗核為材料，提取其中的總黃酮物質(zhì)，可以為棗核的綜合利用提供理論依據(jù)。黃酮類物質(zhì)的主要提取方法有機(jī)溶劑提取法、堿性稀醇或堿性水提取、超濾法、超聲波輔助提取法、微波提取法和酶輔助提取法[3-4]，其中超聲波輔助提取具有提取率高、提取時(shí)間短等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的提取。與正交和均勻設(shè)計(jì)相比，Box-Behnken設(shè)計(jì)可以評(píng)價(jià)指標(biāo)和因素間的非線性關(guān)系，使用方便，條件預(yù)測(cè)性好，對(duì)實(shí)驗(yàn)影響因素的研究較為全面[5-6]。經(jīng)查閱，采用超聲波提取法對(duì)棗核中總黃酮進(jìn)行提取的相關(guān)研究較少[7-8]，本文將以棗核為實(shí)驗(yàn)材料，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)棗核中總黃酮的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在獲取最佳工藝參數(shù)，為棗核的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棗核 烘干后粉碎過40目篩（寧夏靈武地區(qū)靈武長(zhǎng)棗）；蘆丁標(biāo)品 中國(guó)藥品生物制品檢定所。

UV-2550PC型紫外可見分光光度計(jì)日本島津公司；FW-100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；Scientz-ⅡD型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 本實(shí)驗(yàn)以蘆丁為標(biāo)品，采用NaNO2-A l（NO3）3比色法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線[9-10]。蘆丁標(biāo)品濃度C（mg/L）在一定范圍內(nèi)與吸光度A呈良好的線性關(guān)系。線性回歸方程為A=10.866C+0.0025，線性回歸系數(shù)R=0.9991。

1.2.2 棗核中總黃酮的超聲提取工藝及單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取一定量的干燥棗核粉，用50%的乙醇作為浸提劑，在設(shè)定的料液比（1∶40）、超聲功率（300W）、提取溫度（55℃）下超聲提取60min，抽濾得澄清溶液即為粗黃酮提取液。在進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別固定料液比（1∶40）、超聲功率（300W）、提取溫度（55℃）中的兩個(gè)因素，分別考察第三個(gè)因素料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70）、超聲功率（200、250、300、350、400、450W）、提取溫度（25、35、45、55、65、75℃）對(duì)棗核中總黃酮提取率的影響，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 棗核中總黃酮提取率的計(jì)算 準(zhǔn)確量取一定體積的總黃酮提取液，按1.2.1中的相關(guān)步驟，測(cè)吸光度，將數(shù)據(jù)代入線性回歸方程得濾液中總黃酮濃度，再按下式計(jì)算得棗核中總黃酮提取率：Y（mg/g）= C×V/M

式中，C為提取液中總黃酮濃度，mg/L；V為抽濾后得的濾液總體積，L；M為稱取的棗核粉質(zhì)量，g。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以棗核中總黃酮提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[11]，運(yùn)用Design Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，考察料液比、超聲功率、提取溫度及因素間交互作用對(duì)棗核中總黃酮提取率的影響，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素水平表Table1 Factors and levels of response surfacemethodology

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

圖1 料液比對(duì)棗核中總黃酮得率的影響Fig.1 Effectof solid-liquid ratio on extraction of total flavonoids from date seeds

2.1.1 料液比對(duì)棗核總黃酮提取率的影響 圖1為料液比對(duì)總黃酮提取率的影響，由圖1可以看出，當(dāng)料液比在1∶20～1∶50之間時(shí)，黃酮提取率隨料液比增加而增加，當(dāng)料液比在1∶50～1∶70時(shí)，提取率有緩慢下降的趨勢(shì)，這是因?yàn)榱弦罕却髸r(shí)，浸提劑乙醇可以與棗核粉充分接觸，使黃酮類物質(zhì)容易溶出，但是當(dāng)其超過一定范圍時(shí)，會(huì)導(dǎo)致其他雜質(zhì)的過多溶出，從而影響總黃酮的溶解，并且為后續(xù)抽濾分離帶來(lái)負(fù)擔(dān)，增加成本。

2.1.2 超聲功率對(duì)棗核總黃酮提取率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)超聲功率小于300W時(shí)，總黃酮得率隨著超聲功率的增加而迅速提高，當(dāng)超聲功率達(dá)到300W時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最大值5.78mg/g，功率繼續(xù)增大時(shí)，提取率反而下降，這是因?yàn)槌暡梢允怪参锛?xì)胞壁形成較多的小孔，增強(qiáng)細(xì)胞膜的透性，利于胞內(nèi)物質(zhì)的溶出，但是功率過大會(huì)對(duì)黃酮類物質(zhì)造成破壞，并且會(huì)增加能耗，增加提取成本。

圖2 超聲功率對(duì)棗核中總黃酮得率的影響Fig.2 Effectof ultrasonic power on extraction of total flavonoids from date seeds

2.1.3 提取溫度對(duì)棗核總黃酮提取率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)溫度小于55℃時(shí)，隨著溫度的增高，棗核中總黃酮得率也隨之增加，但是當(dāng)提取溫度超過55℃時(shí)，總黃酮得率開始下降，這是因?yàn)檫m當(dāng)提高溫度可以增強(qiáng)超聲波對(duì)細(xì)胞的破壞作用，并加快總黃酮的滲透和擴(kuò)散速度[12]，但是溫度過高時(shí)，黃酮物質(zhì)發(fā)生降解，并且長(zhǎng)時(shí)間加熱，導(dǎo)致浸提劑乙醇揮發(fā)，影響黃酮的浸出，因此確定提取溫度在55℃左右比較合適。

圖3 提取溫度對(duì)棗核中總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction of total flavonoids from date seeds

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化總黃酮提取工藝的結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立與分析 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析，設(shè)計(jì)17次實(shí)驗(yàn)，其中析因?qū)嶒?yàn)12次，中心組合實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表2所示，方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Design and results of response surfacemethodology

利用Design Expert 8.0軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到響應(yīng)回歸方程：

式中，Y為棗核中總黃酮含量的預(yù)測(cè)值，A、B、C分別為料液比、超聲功率、提取溫度。

由表3的方差分析可知，該模型高度顯著（p＜0.0001），失擬項(xiàng)不顯著（p=0.6809＞0.05），決定系數(shù)R2=0.9895，校正系數(shù)R=0.9760，表明此模型對(duì)于棗核中總黃酮得率實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有很好的擬合度，可用該模型對(duì)棗核中總黃酮得率進(jìn)行很好地分析和預(yù)測(cè)。

由表3還可看出，所選3個(gè)因素及之間的交互作用對(duì)總黃酮得率有顯著影響，其中超聲功率B和提取溫度C分別對(duì)總黃酮提取率有極顯著的影響，料液比和提取溫度之間的交互作用極顯著，且由p值和F值可以看出，各因素對(duì)總黃酮提取率影響的順序?yàn)椋禾崛囟龋境暪β剩玖弦罕取?/p>

圖4 超聲功率和料液比交互作用的響應(yīng)面Fig.4 Response surface of ultrasonic power and solid-liquid ratio

表3 回歸方差分析表Table3 Variance analysis ofmathematical regressionmodel

2.2.2 響應(yīng)面分析 響應(yīng)曲面三維圖可以直觀的反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度及因素間的交互作用強(qiáng)弱，三維圖在平面上的投影即為等高線圖，等高線形狀反映了交互影響的強(qiáng)弱，等高線趨于圓形時(shí)，兩因素的交互作用相對(duì)較弱；等高線為橢圓形時(shí)，兩因素的交互作用相對(duì)較強(qiáng)[13]，回歸模型的響應(yīng)面分析所作的響應(yīng)曲面圖如圖4～圖6所示。從圖4～圖6可以看出，所選三個(gè)因素的主效應(yīng)顯著，并且因素之間的交互作用也較大，與方差分析的結(jié)果相吻合；從三組三維曲面圖可以看出提取溫度溫度相較于超聲功率、料液比的曲線較陡峭，說明溫度對(duì)于總黃酮提取的影響最為顯著；當(dāng)提取溫度固定時(shí)，超聲功率的曲線比料液比的陡峭，再一次的驗(yàn)證了棗核總黃酮的提取過程中，超聲功率的影響比料液比的大。由圖4可以看出，三維圖的投影等高線圖呈橢圓形，并且橢圓的軸線與縱、橫坐標(biāo)存在著一定的角度，說明料液比和提取溫度存在著極顯著的交互作用，這與回歸方差分析表的結(jié)果相吻合。

圖5 提取溫度和料液比交互作用的響應(yīng)面Fig.5 Response surface of extraction temperature and solid-liquid ratio

圖6 提取溫度和超聲功率的響應(yīng)面Fig.6 Response surface of extraction temperature and ultrasonic power

2.2.3 最佳工藝的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證 利用D esign-expert 8.0的optim ization功能，將總黃酮提取率的Goal選項(xiàng)選擇為m aximize，可得到唯一一個(gè)優(yōu)化方案，即：料液比1∶49.57、超聲功率為305.59W、提取溫度為58.15℃，棗核中總黃酮得率預(yù)測(cè)值為7.06mg/g?？紤]實(shí)際操作過程的方便性，選擇提取工藝參數(shù)為：料液比1∶50、超聲功率305W、提取溫度60℃，在該工藝下進(jìn)行五次平行實(shí)驗(yàn)所得的總黃酮平均得率為7.03mg/g，與預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)誤差僅為0.43%，表明用響應(yīng)面法對(duì)棗核中總黃酮超聲提取的各因素進(jìn)行優(yōu)化研究是合理可行的，可以為工業(yè)化的生產(chǎn)提供合理的方案。

3 結(jié)論

采用超聲法提取棗核中的總黃酮，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)曲面分析優(yōu)化工藝條件，并結(jié)合實(shí)際操作確定棗核中總黃酮超聲提取的最佳工藝為：料液比1∶50、超聲功率305W、提取溫度60℃，提取率為7.03mg/g，提取率較高，對(duì)棗核中總黃酮進(jìn)行提取利用是工業(yè)下腳料棗核資源化的有效途徑，可為棗核的再利用提供參考依據(jù)。

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