乳清多肽螯合鈣的制備與結(jié)構(gòu)表征

肖 珊，黃立新，趙璧秋

（1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640；2.廣州市華僑糖廠，廣東廣州510280）

鈣為人體內(nèi)含量最多的一種無機(jī)元素，所有的生命過程基本上均需要鈣的參與[1-2]，缺鈣可導(dǎo)致人體產(chǎn)生骨質(zhì)疏松、佝僂癥等多種疾病[3]。到目前為止，經(jīng)中國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的鈣制劑保健食品有近900個(gè)，鈣類藥品達(dá)1740多個(gè)[4]。盡管補(bǔ)鈣產(chǎn)品種類豐富，但鈣的生物利用度低，導(dǎo)致補(bǔ)鈣效果與補(bǔ)鈣量不成正比，尋找新技術(shù)改善補(bǔ)鈣制劑的補(bǔ)鈣效果倍受國內(nèi)外的關(guān)注。導(dǎo)致人體缺鈣的主要原因有：在正常人中，鈣結(jié)合蛋白對鈣的轉(zhuǎn)運(yùn)能力是一個(gè)常量，單純依靠鈣結(jié)合蛋白為細(xì)胞內(nèi)提供鈣并不能滿足機(jī)體需要；離子鈣在胃、小腸的酸度條件下，Ca2+易生成不溶物，導(dǎo)致其吸收率下降[3-5]。

Agar（1953）[6]、Adibi（1984）[7]、Hara（1984）[8]、Rerat（1988）[9]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了“小肽優(yōu)先吸收理論”：小肽中氨基酸殘基的吸收速率要大于等量游離氨基酸的吸收速率。依此，國內(nèi)外的科研者們陸續(xù)展開了小肽與鈣螯合反應(yīng)的研究，并得到“小肽與鈣螯合，不易飽和，吸收速度快，耗能低，更有利于提高鈣的生物學(xué)效價(jià)”的結(jié)果[10-15]。

乳清蛋白被譽(yù)為是“蛋白之王”，具有高吸收性、完整的氨基酸成分、低脂肪和膽固醇的特點(diǎn)[16]，是當(dāng)今最常見的蛋白質(zhì)補(bǔ)充產(chǎn)品之一[17]。目前，國內(nèi)外科研者多以魚骨架、牛骨、雞羽毛、雞肉、豆粕、米渣、血粉、蛋清等為原料，水解制得蛋白肽，與鈣螯合后得到“蛋白肽螯合鈣”。本文以乳清蛋白為原料制取多肽，再與鈣鹽反應(yīng)制得乳清多肽螯合鈣，為多肽螯合鈣產(chǎn)品的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

濃縮乳清蛋白WPC80 美國Hilmar公司；堿性蛋白酶（酶活＞200000U/g） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；無水氯化鈣、氫氧化鈉、乙醇（95%） 分析純。

pHS-3C精密pH計(jì) 上海雷磁；FA2004B電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器 金壇市醫(yī)療儀器廠；恒溫水浴鍋 北京永光明醫(yī)療儀器廠；TDL-5-A離心機(jī) 上海安亭（飛鴿）；NICOLET-6700紅外光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；UV500紫外可見分光光度計(jì) 英國UNICAN；X’Pert PRO X-射線衍射光譜儀 荷蘭帕納科公司；TGA Q500熱重分析儀 美國Waters公司；Hitachi S3700N掃描電鏡 H itachi公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳清多肽的制備 配制一定濃度的乳清蛋白溶液（5g/100m L），調(diào)節(jié)pH至10.5，60℃恒溫10m in，加入蛋白酶0.3g，振蕩水解5h。水解結(jié)束后置沸水浴中滅酶10min，取出迅速冷卻，50℃烘干、研磨（至過80目篩）。測得乳清多肽水解度約30%。

1.2.2 乳清多肽螯合鈣的制備與提純 配制濃度為2%的乳清多肽溶液，NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，加入鈣鹽，攪拌溶解，在恒溫振蕩水浴中反應(yīng)一定時(shí)間，用反應(yīng)液15倍以上體積乙醇沉淀，3500r/m in離心10m in收集沉淀，乙醇洗滌至上清液加入鈣指示劑不變色（仍顯示藍(lán)色），加入茚三酮指示劑加熱后不變紫，50℃烘干，研磨拌研磨（至過100目篩）得產(chǎn)品[18-19]。

1.2.3 合成乳清多肽螯合鈣的單因素實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)中以0.06g乳清多肽配制成30m L水溶液為基礎(chǔ)，溶液分別以鈣鹽質(zhì)量（0.01、0.2、0.3、0.6、1.0、1.2、1.5、2.0、3.0、4.0g），溶液初始pH（5、6、7、8、9、10、11、12），反應(yīng)溫度（35、45、55、60、65、75℃），時(shí)間（5、10、20、30、40、50、60min）為影響因素，以鈣含量或螯合率為指標(biāo)，考察各因素對螯合鈣反應(yīng)的影響。反應(yīng)基本條件依次為：pH 8、60℃、反應(yīng)時(shí)間60m in、鈣鹽質(zhì)量1.2g。

1.2.4 合成乳清多肽螯合鈣的正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取合適的因素水平，以鈣螯合率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 乳清多肽螯合鈣合成的正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels ofwhey polypeptide chelating calcium orthogonal experiment

1.2.5 鈣螯合率的測定

1.2.5.1 鈣含量的測定方法 參照GB/T 5009.92-2003食品中鈣的測定中的滴定法（EDTA法）[20]。其中10g/L氰化鈉溶液用三乙醇胺溶液（與蒸餾水體積比1∶2）替代，每次滴定前加入2～3m L。

1.2.5.2 總鈣含量的測定 準(zhǔn)確移取0.1m L反應(yīng)液于三角瓶中，加入50m L蒸餾水，加入2～3m L三乙醇胺（1∶2），搖勻，用滴定管加0.8～1m L 1.25mol/L氫氧化鉀溶液至pH為12～13，搖勻，加入適量鈣指示劑，搖勻，立即以稀釋10倍EDTA溶液（已標(biāo)定每m L EDTA相當(dāng)于0.0456mg Ca）滴定，至溶液由紫紅色變純藍(lán)色為止，記EDTA溶液體積V0。按公式（1）可計(jì)算可得總鈣含量M0（g）：

1.2.5.3 螯合鈣含量的測定 準(zhǔn)確移取1m L反應(yīng)液于50m L離心管中，加入20m L乙醇，溫水浴中振搖1h，3500r/m in離心10m in，棄上清液，沉淀定容至20m L溶液，取2m L溶液EDTA滴定，同1.2.5.2步驟，記EDTA溶液體積V1?？砂垂剑?）得螯合鈣含量M1（g）：

1.2.5.4 鈣螯合率 計(jì)算方法如公式3所示：

式中：M0、M1分別表示0.1m L反應(yīng)液中總鈣的含量、螯合鈣的含量（g）。

1.2.6 乳清多肽螯合鈣的表征

1.2.6.1 掃描電鏡和能譜分析 乳清多肽與乳清多肽螯合鈣粉末分別用掃描電鏡觀察拍攝樣品形態(tài)，并在加速壓20.00kv的條件下進(jìn)行能譜分析。

1.2.6.2 紅外光譜分析 采用KBr壓片法，累加掃描次數(shù)32次。

1.2.6.3 紫外光吸收曲線 配制濃度為1%的乳清多肽與乳清多肽螯合鈣溶液，于波長190～350nm下掃描。

1.2.6.4 鈣含量分析 精確稱取約0.0100g的乳清多肽與最佳工藝條件下合成的乳清多肽螯合鈣，溶解在5m L容量瓶中定容。取2m L溶液，采用1.2.5中EDTA滴定法測定鈣含量，計(jì)算得到樣品中鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.6.5 TGA熱重分析 樣品質(zhì)量約2.5mg。氮?dú)饬髁浚禾炱?0m L/m in，樣品60m L/min，升溫速率為：30℃/m in，溫度范圍為40～1000℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 鈣鹽用量的影響 乳清多肽螯合鈣反應(yīng)的理想情況是一定量的乳清多肽能與盡可能多的鈣離子發(fā)生螯合，亦即所得單位質(zhì)量產(chǎn)物中鈣離子含量最多。螯合反應(yīng)產(chǎn)物中鈣離子含量（%）與加入鈣鹽質(zhì)量（g）的變化關(guān)系如圖1所示。

圖1 鈣鹽質(zhì)量對螯合產(chǎn)物中鈣含量的影響Fig.1 Effectof calcium ion weighton the Ca2+content in product

由圖1可知，在0.01～2g內(nèi)，隨著鈣鹽加入越多，螯合產(chǎn)物中鈣含量也逐漸增加。當(dāng)鈣鹽質(zhì)量增至3～4g間，螯合產(chǎn)物中鈣含量趨于不變。因此，確定加入鈣鹽的質(zhì)量在3g左右，此時(shí)螯合物中的鈣含量約為10%。

2.1.2 反應(yīng)液初始pH的影響 由圖2可知，隨著反應(yīng)初始pH升高，鈣離子螯合率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當(dāng)初始反應(yīng)液為酸性時(shí)，溶液中H+較多，會(huì)抑制多肽-COOH中的H+電離（式4），同時(shí)易使-NH2結(jié)合一個(gè)H+而帶上正電（式5），阻礙二者與鈣離子的螯合反應(yīng)，因此鈣螯合率較低。與此相反，當(dāng)初始反應(yīng)液呈堿性時(shí)，溶液中OH-較多，有利于肽-COOH中的H+電離及-NH2失去一個(gè)H+而帶上負(fù)電（式6），均有利于二者與鈣離子的螯合反應(yīng)，因此鈣螯合率逐漸增大。但當(dāng)初始反應(yīng)液pH超過11左右時(shí)，鈣螯合率又減少了，這是由于在強(qiáng)堿性條件下鈣離子與過多的OH-形成CaOH沉淀，而參與螯合反應(yīng)的Ca2+減少了。綜合實(shí)驗(yàn)和以上的理論分析，適宜的初始反應(yīng)液pH為10～11。

圖2 反應(yīng)液初始pH對鈣離子螯合率的影響Fig.2 Effectof the initial pH of reaction liquid on Ca2+chelating rate

圖3 反應(yīng)溫度對鈣離子螯合率的影響Fig.3 Effectof reaction temperature on Ca2+chelating rate

2.1.3 反應(yīng)溫度的影響 實(shí)驗(yàn)如圖3所示。隨著反應(yīng)溫度的升高，鈣離子螯合率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。反應(yīng)溫度在35～65℃時(shí)，溫度越高，鈣離子螯合率越大，這是由于分子及離子熱運(yùn)動(dòng)加強(qiáng)，使反應(yīng)物間碰撞并發(fā)生螯合的幾率增大。而當(dāng)溫度大于65℃時(shí)，乳清多肽分子可能發(fā)生變性，部分團(tuán)聚，導(dǎo)致能與鈣離子的反應(yīng)的基團(tuán)變少，鈣離子螯合率便降低。綜合以上因素，選擇合成的適宜溫度約60～70℃。

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間的影響 結(jié)果見圖4?？梢婋S著反應(yīng)時(shí)間的延長，鈣離子螯合率逐漸增大，而后趨于平緩。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在5～20m in間時(shí)，鈣離子螯合率迅速增加；而后40～50m in時(shí)，鈣離子螯合率趨于穩(wěn)定。因此，確定反應(yīng)時(shí)間在40～50m in較適宜。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對鈣離子螯合率的影響Fig.4 Effect of reaction time on Ca2+chelating rate

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。各因素對結(jié)果的影響為：鈣鹽量＞反應(yīng)時(shí)間＞溫度=溶液初始pH，優(yōu)化后的因素水平組合為A2B2C1D3，即當(dāng)乳清多肽溶液質(zhì)量溶度為2%時(shí)，反應(yīng)溫度65℃，溶液初始pH 10.5，鈣鹽質(zhì)量為3g（乳清多肽與鈣鹽質(zhì)量比為1∶5），反應(yīng)時(shí)間50m in。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：此最優(yōu)條件下鈣螯合率為7.45%。

表2 乳清多肽螯合鈣合成的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Orthogonal experiment resultofwhey polypeptide chelating calcium

2.3 乳清多肽螯合鈣的表征

2.3.1 乳清多肽螯合鈣掃描電鏡 乳清多肽粉末與乳清多肽螯合鈣粉末的掃描電鏡圖見圖5、圖6。由圖可見乳清多肽的表面呈多孔狀，這可能是由乳清多肽水解液在干燥過程中水分汽化逸出時(shí)形成的小氣孔；能譜分析確定乳清多肽中含有Ca、K、S、P、Na等元素，其中Ca含量較少。其次，乳清多肽螯合鈣顆粒大小不一，無定形狀，表面粗糙，為交織團(tuán)狀的結(jié)構(gòu)。能譜分析確定乳清多肽螯合鈣中含有Ca、Cl、S、P、Na等元素，其中Ca元素的含量較乳清多肽明顯增多。

圖5 乳清多肽電鏡顯微照片（10000×）及其能譜圖Fig.5 Electronmicroscopy（10000×）and energy spectrum diagram ofWhey peptides

圖6 乳清多肽螯合鈣電鏡顯微照片（10000×）及其能譜圖Fig.6 Electronmicroscopy（10000×）and energy spectrum diagram ofwhey polypeptide chelating calcium

圖7 乳清多肽與乳清多肽螯合鈣的紅外光譜對比分析Fig.7 Infrared spectrum analysis ofwhey peptides and whey peptides chelating calcium

2.3.2 紅外光譜分析 乳清多肽與乳清多肽螯合鈣樣品的紅外光譜圖見圖7。乳清多肽的紅外光譜見上方曲線，在特征區(qū)，-NH2的吸收峰在3386cm-1；指紋區(qū)，C=O的吸收峰在1647cm-1，-COO-的吸收峰在1397cm-1。乳清蛋白肽螯合鈣的紅外光譜見下方曲線，在特征區(qū)，-NH2的吸收峰移動(dòng)到了3392cm-1，發(fā)生了變化，說明乳清蛋白水解肽中的-NH2鍵發(fā)生了的化學(xué)反應(yīng)；在指紋區(qū)，C=O的吸收峰紅移至1649cm-1，-COO-的吸收峰紅移至1416cm-1，可見，-COO-鍵也發(fā)生了的化學(xué)反應(yīng)，表明氨基和羧基均參與了鈣的螯合反應(yīng)。

2.3.3 紫外光吸收曲線 乳清多肽與乳清多肽螯合鈣溶液紫外光吸收曲線見圖8。前者的出峰波長為212、280nm；而乳清多肽螯合鈣溶液的出峰波長為203nm，在280nm處的峰則大大減弱。乳清多肽與鈣離子螯合后，第一個(gè)特征峰由212nm移到203nm，這也證實(shí)了乳清多肽中某些基團(tuán)發(fā)生了反應(yīng)。

圖8 乳清多肽與乳清多肽螯合鈣的紫外吸收曲線Fig.8 Ultraviolet absorption curve ofwhey peptides and whey peptides chelating calcium

2.3.4 鈣含量分析 乳清多肽與乳清多肽螯合鈣的鈣含量的測定結(jié)果見表3，乳清多肽中原本含有少量的鈣，加入鈣鹽與之反應(yīng)后大大增加了鈣的含量，結(jié)果與2.3.1的能譜檢測結(jié)果一致。

表3 乳清多肽與乳清多肽螯合鈣的鈣含量分析Table3 Calcium content analysis ofwhey peptides and whey peptides chelating calcium

2.3.5 TGA熱重分析 乳清多肽與乳清多肽螯合鈣的質(zhì)量隨溫度變化曲線見圖9。隨溫度的升高，樣品質(zhì)量逐漸減少。105℃前主要是水分的散失，二者水分含量相近，約3%～5%。當(dāng)溫度高于200℃時(shí)，有機(jī)成分開始逐漸分解，由圖9可見，當(dāng)二者質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低點(diǎn)趨于不變時(shí)，乳清多肽螯合鈣所需溫度（907℃）比乳清多肽所需溫度（629℃）高許多，這說明乳清多肽與鈣離子螯合后分子間及分子內(nèi)的作用力更大了，因此，要破壞此作用力使分子分解所需的溫度也就更高。熱重檢測結(jié)果可得乳清多肽的灰分含量約為4.82%，乳清多肽螯合鈣的灰分含量約為14.67%，后者比前者灰分含量高出10%左右，主要為鈣元素的含量，這一結(jié)果與2.3.1與2.3.4中的結(jié)果具有一致性。

圖9 乳清多肽與乳清多肽螯合鈣TGA熱重曲線Fig.9 TGA thermogravimetric curve ofwhey peptides and whey peptides chelating calcium

3 結(jié)論

當(dāng)乳清多肽溶液質(zhì)量溶度為2%時(shí)，乳清多肽螯合鈣合成的最佳工藝為：乳清多肽與鈣鹽質(zhì)量比為1∶5，多肽溶液初始pH為10.5，反應(yīng)溫度為65℃，反應(yīng)時(shí)間為50m in，此最優(yōu)條件下鈣螯合率為7.45%，所得產(chǎn)物Ca2+含量為10.5%±0.5%。當(dāng)乳清多肽與鈣離子發(fā)生螯合反應(yīng)后，產(chǎn)物顯微可見表面的多孔狀結(jié)構(gòu)及微小的顆粒，官能團(tuán)-NH2、-COO-的紅外吸收峰會(huì)發(fā)生偏移，紫外光吸收曲線的波峰也會(huì)發(fā)生偏移；TGA熱重分析表明乳清多肽螯合鈣需要較高的溫度才能分解。

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