微波輔助提取蠶豆種皮中總黃酮的條件優(yōu)化

馮學(xué)花，張國升，陶阿麗，曹殿潔

（安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽合肥230088）

蠶豆為豆科植物蠶豆Vicia faba L.的種子，又稱胡豆、佛豆、川豆、倭豆、羅漢豆，亦食亦藥，蠶豆種皮即為蠶豆的種皮，為糧食、蔬菜和飼料、綠肥兼用作物，其種植以四川最多，其次為云南、安徽、浙江、青海等省[1]。蠶豆種皮具有健脾利濕的功效，《本草從新》稱其能“補(bǔ)中益氣，澀精，實(shí)腸”。文獻(xiàn)報(bào)道在蠶豆種皮中含有多種對人體有益的生理活性成分，即所謂的植物化學(xué)成分，如黃酮類物質(zhì)、原花青素、活性蛋白、活性肽及巢菜堿苷等?，F(xiàn)代研究表明黃酮具有降血壓、降血脂、擴(kuò)張冠狀動脈等作用[2]。

與傳統(tǒng)溶劑提取法相比，微波提取技術(shù)具有：作用時間短、速度快、提取效率高、節(jié)能等顯著特點(diǎn)[3]。目前，國內(nèi)對于蠶豆種皮提取物的研究主要集中在原花青素的提取方面而對黃酮的研究較少。本文對蠶豆種皮總黃酮提取條件進(jìn)行研究，利用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)相結(jié)合的方法對蠶豆種皮總黃酮提取條件進(jìn)行優(yōu)化，為提高蠶豆皮的附加值，進(jìn)一步研究開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠶豆 采自合肥市西郊（經(jīng)安徽新華學(xué)院藥物研究所鑒定為豆科植物蠶豆Vicia faba L.的種子），剝?nèi)》N皮，置烘箱中，在60℃條件下干燥24h后用粉碎機(jī)粉碎過40目篩，所得粉末用棕色廣口瓶收集，密封備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、三氯化鐵、三氯化鋁、濃氨水 分析純。

LD-1000型中藥粉碎機(jī) 長沙市常宏制藥機(jī)械設(shè)備廠；756型紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；G80F20CN2L-B8（R0）型Galanz/格蘭仕微波爐 廣東格蘭仕電器有限公司；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海洪旋實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；PHS-3C型雷磁酸度計(jì)（pH計(jì)） 上海精密科學(xué)儀器有限公司；循環(huán)水式真空泵 河南鞏義市英峪儀器廠；AL204-IC型電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器（中國）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取在120℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品100mg，置100m L量瓶中，加甲醇70m L，置水浴上微熱使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻。精密吸取10m L，置100m L量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)溶液（每1m L中含無水蘆丁0.1mg）[4]。精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1mg/m L）0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0m L，分別置于10m L量瓶中，各加30%乙醇至5.0m L，各精密加入5%亞硝酸鈉溶液0.3m L，充分搖勻，放置6m in。各精密加入10%硝酸鋁溶液0.3m L，充分搖勻，放置6m in。各加1mol/L氫氧化鈉溶液4.0m L，用蒸餾水稀釋至刻度，充分搖勻，放置15m in，用紫外可見分光光度法，在510nm波長處測定吸光度，以溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[5]。

1.2.2 總黃酮的微波輔助提取 精確秤取10.0g蠶豆種皮粉末置于磨口三角瓶中，選取液料比、提取時間、提取功率三個因素，在不同條件下進(jìn)行微波提取。提取后立即冰浴冷卻，抽濾，吸取適量提取液測定黃酮含量，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，測定吸光值，按照下式計(jì)算產(chǎn)率[6]。

總黃酮產(chǎn)率（%）=提取液中黃酮質(zhì)量（g）/蠶豆種皮干粉末質(zhì)量（g）×100

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)方法 以蠶豆種皮為原料，利用微波萃取法研究乙醇濃度、微波提取時間、微波功率及液料比對蠶豆種皮總黃酮產(chǎn)率的影響。

1.2.3.1 微波功率的選擇 取上述經(jīng)干燥粉粹后的蠶豆種皮適量，加70%乙醇25倍量，分別在200、300、400、500、600、700W不同的微波功率條件下，萃取40s，考察不同微波功率對蠶豆種皮總黃酮產(chǎn)率的影響。

1.2.3.2 提取時間的選擇 取上述經(jīng)干燥粉粹后的蠶豆種皮適量，加70%乙醇25倍量，分別在500W微波功率條件下萃取10、20、30、40、50、60s時間，考察不同提取時間對蠶豆種皮中總黃酮產(chǎn)率的影響。

1.2.3.3 液料比的選擇 取上述經(jīng)干燥粉粹后的蠶豆種皮適量，分別加10、15、20、25、30、35倍量的70%乙醇在500W微波功率條件下，萃取40s，考察不同液料比對蠶豆種皮總黃酮產(chǎn)率的影響。

1.2.3.4 乙醇濃度的選擇 取上述經(jīng)干燥粉粹后的蠶豆種皮適量，分別加40%、55%、70%、85%、95%乙醇25倍量，在500W微波功率條件下進(jìn)行微波提取，考察不同乙醇濃度對蠶豆種皮總黃酮產(chǎn)率的影響。

1.2.4 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過單因素實(shí)驗(yàn)確定主要的影響因素及各因素的適當(dāng)范圍，依據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)原理，采用響應(yīng)面分析法，以液料比、微波功率和提取時間三個因素為自變量，以蠶豆種皮總黃酮產(chǎn)率為因變量，應(yīng)用Design-Expert 8.0.5軟件，采用三因素三水平實(shí)驗(yàn)，分析因素與水平見表1。

表1 因素水平表Table1 Table of factors and levels

2 結(jié)果與討論

2.1 線性回歸方程

根據(jù)各濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液對應(yīng)的吸光度，計(jì)算得到線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9994，回歸方程為A＝13.297C-0.0371。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 微波功率對提取效果的影響 不同微波功率對蠶豆種皮中總黃酮產(chǎn)率的影響見圖1。

圖1 微波功率對總黃酮產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect ofmicrowave power ethanol concentration on the yield of total flavonoid

由圖1可知，黃酮產(chǎn)率隨微波功率的增大先上升后下降，當(dāng)微波功率為500W時，其產(chǎn)率最佳。繼續(xù)增大功率時，產(chǎn)率降低，這是因?yàn)楣β蔬^大，溶液中的水分子振動劇烈，溫度急劇升高，溶劑揮發(fā)太快，而且強(qiáng)熱效應(yīng)易破壞黃酮，導(dǎo)致產(chǎn)率下降[6-7]。

2.2.2 提取時間對提取效果的影響 不同提取時間對蠶豆種皮中總黃酮產(chǎn)率的影響見圖2。

圖2 提取時間對總黃酮產(chǎn)率的影響Fig.2 Effectofand extraction time on the yield of total flavonoid

由圖2可知，隨著時間的增加，黃酮產(chǎn)率先增加后降低，40s時的產(chǎn)率最高，為0.39%?？赡苁情L時間后微波的強(qiáng)熱效應(yīng)造成黃酮部分分解及且溶劑蒸發(fā)導(dǎo)致黃酮溶出減少[8]。

2.2.3 液料比對提取效果的影響 不同液料比對蠶豆種皮中總黃酮產(chǎn)率的影響見圖3。

由圖3可見，隨著液料比的增加，總黃酮產(chǎn)率增加。當(dāng)液料比達(dá)到25∶1時，產(chǎn)率最高為0.49%，此后液料比增加，總黃酮產(chǎn)率下降，可能由于溶劑用量太大，會使熱負(fù)荷增大，提取完全所需要的時間增加，使所提取溶液中黃酮濃度降低。

2.2.4 乙醇濃度對提取效果的影響 不同乙醇濃度對蠶豆種皮總黃酮產(chǎn)率的影響見圖4。

從圖4可知，乙醇濃度在40%～70%范圍內(nèi)，黃酮產(chǎn)率隨乙醇濃度的增大而增加，乙醇濃度大于70%以后，黃酮產(chǎn)率隨著乙醇濃度增大而下降，這是由于黃酮類是一類極性范圍較廣的化合物，在70%的乙醇溶液中，黃酮類物質(zhì)能夠最大限度地溶出，而當(dāng)乙醇濃度增大時，水溶性黃酮溶出量開始減少，而出現(xiàn)黃酮的產(chǎn)率下降[4]。

圖3 不同料液比對總黃酮產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the yield of total flavonoid

圖4 乙醇濃度對總黃酮產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoid

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析見表2、表3。

由方差分析表3可知，回歸模型高度顯著（p＜0.0001），失擬項(xiàng)不顯著（p=0.1371＞0.05）以及R2= 0.7767和Adeq Precision=19.549，遠(yuǎn)大于4，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，能夠很好地對黃酮產(chǎn)率進(jìn)行預(yù)測。由回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，模型的一次項(xiàng)A（p=0.0011＜0.01），一次項(xiàng)B（p＜0.0001）對黃酮提取的線性效應(yīng)極顯著，而提取時間對產(chǎn)率沒有顯著影響（p=0.0598＞0.05）；二次項(xiàng)B2（p＜0.0001）對黃酮提取的曲面效應(yīng)極顯著，而A2（p=0.1416＞0.05）、C2（p=0.3480＞0.05）均不顯著；交互項(xiàng)BC（p=0.0007＜0.01）極顯著，AB、AC不顯著；表明各影響因素對黃酮產(chǎn)率的影響不是簡單的線性關(guān)系[4，9]。由模型擬合得到的回歸方程為：Y=0.51+0.032A-0.0049B+0.014C+0.013AB-0.0017AC-0.005BC-0.014A2-0.12B2+0.0085C2。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of composite design

2.4 條件優(yōu)化與預(yù)測

表3 方差分析表Table3 Analysis of variance

各因素對黃酮產(chǎn)率的響應(yīng)面圖見圖5～圖7。應(yīng)用Design-Expert 8.0.5軟件求導(dǎo)可得，當(dāng)液料比為26.83∶1（m L/g）、微波功率為461.3W、提取時間為50s時，響應(yīng)值（產(chǎn)率）預(yù)測的最大值0.5521%[6，10-11]。

圖5 料液比與微波功率對提取產(chǎn)率的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Three-dimensional response surface graph of liquid-solid ratio，microwave power for extraction yield

圖6 料液比與提取時間對提取產(chǎn)率的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Three-dimensional response surface graph of solid-liquid ratio，extraction time for extraction yield

圖7 微波功率與提取時間對提取產(chǎn)率的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Three-dimensional response surface graph ofmicrowave power，extraction time for extraction yield

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)二次回歸的數(shù)學(xué)模型分析結(jié)果，最優(yōu)條件為液料比為26.83∶1（m L/g）、微波功率為461.3W、提取時間為50s時，響應(yīng)值（產(chǎn)率）預(yù)測的最大值為0.5521%。考慮到實(shí)際操作性，對響應(yīng)面二次回歸所得最佳條件進(jìn)行修正，確定蠶豆種皮的最佳提取條件為：液料比為27∶1（m L/g）、微波功率為460W、提取時間為50s。為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性，根據(jù)上述修正后條件，再平行提取蠶豆種皮3份，測定總黃酮平均值為0.5469%，將所得實(shí)測值與二項(xiàng)式擬合方程預(yù)測的最大值進(jìn)行比較，計(jì)算偏差，結(jié)果平均偏差為0.94%，偏差較小，說明該模型有效。

3 結(jié)論

通過單因素與響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定了蠶豆種皮總黃酮提取的優(yōu)化工藝條件為：液料比為27∶1（m L/g）、微波功率為460W、提取時間為50s。在此工藝條件下響應(yīng)值（產(chǎn)率）預(yù)測的最大值為0.5521%，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證值為0.5469%，偏差較小，因此響應(yīng)面設(shè)計(jì)的結(jié)果較為準(zhǔn)確可靠，可用于微波輔助提取蠶豆種皮總黃酮工藝條件的優(yōu)化和預(yù)測。

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