傳統(tǒng)魚露發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)乳酸菌的分離、純化與初步鑒定

張 豪，章超樺，曹文紅，李瑞杰

（廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

魚露（fish sauce）亦稱魚醬油，其營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，是我國(guó)東南沿海、日本以及東南亞一帶的傳統(tǒng)調(diào)味料，在國(guó)內(nèi)又以潮汕魚露最為典型[1]。傳統(tǒng)的魚露生產(chǎn)是鹽漬和發(fā)酵兩者相結(jié)合的產(chǎn)物，即利用鹽漬抑制腐敗微生物，通過魚體自身的蛋白酶以及微生物的共同作用進(jìn)行水解的過程，從而達(dá)到生產(chǎn)魚露的目的[2]。眾所周知，魚露在前期鹽漬自溶的基礎(chǔ)上，通過中后期長(zhǎng)期的陳化，慢慢形成魚露所特有的風(fēng)味。乳酸菌作為魚露中后期發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)菌，其變化與魚露的各項(xiàng)理化指標(biāo)及游離氨基酸的變化有著密切的聯(lián)系，并對(duì)魚露風(fēng)味的形成有著積極的貢獻(xiàn)[3-5]。而目前對(duì)魚露中后期風(fēng)味形成有著密切聯(lián)系的優(yōu)勢(shì)菌——乳酸菌研究還比較少。

本實(shí)驗(yàn)旨在通過對(duì)后期發(fā)酵液的不同階段（12、15、18、21、24個(gè)月）中乳酸菌的分離鑒定，從而獲得貫穿整個(gè)發(fā)酵中后期的優(yōu)勢(shì)菌種，并研究其生化特性及酶活性。以期對(duì)中后期乳酸菌種類、特性有一定的了解，為進(jìn)一步探究乳酸菌對(duì)魚露風(fēng)味的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

傳統(tǒng)魚露發(fā)酵樣品 發(fā)酵周期為兩年，以藍(lán)圓鲹為原料，與一定比例的海鹽混合，在（30±5）℃下分別已自然發(fā)酵12、15、18、21、24個(gè)月，由廣東省汕頭魚露廠有限公司提供；分離培養(yǎng)基、MC固體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、吲哚實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基、H2S產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基、糖醇類碳源發(fā)酵管 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；NaCl等試劑 均為分析純，廣州化學(xué)試劑公司。

表1 5個(gè)分離菌株的形態(tài)特征Table1 Characteristics of five isolated strains

01J2003-04立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；sky-1102C恒溫培養(yǎng)搖床 上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SLI-700恒溫培養(yǎng)箱 上海愛朗儀器有限公司；PHS-2pH計(jì) 上海精科；UX2200H電子天平 SHIMADZU CORPORATION JAPAN；L1100雙目微生物顯微鏡 廣州市廣精精密儀器有限公司；島津UV-2550紫外可見分光光度計(jì)日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法[6-7]

1.2.1 發(fā)酵液樣品的采集 傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程是一個(gè)開放的環(huán)境，因此，在取樣時(shí)，要盡量避免外界空氣雜菌的影響，所取不同階段的發(fā)酵液均為距其上表面8～12cm處的樣品。

1.2.2 乳酸菌的分離 在MC固體培養(yǎng)基中，選取具有明顯數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)的菌株劃線分離，直到得到純菌株。純化后的菌株分別接種到MRS斜面培養(yǎng)基，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 乳酸菌的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將分離純化后的菌株涂布到MRS固體培養(yǎng)基上，（35±0.2）℃下培養(yǎng)48h，觀察菌落特征，取典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并在油鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.3.2 生理生化實(shí)驗(yàn) 對(duì)分離后的菌株進(jìn)行接觸氧化酶實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)；用半固體培養(yǎng)基測(cè)定菌株的運(yùn)動(dòng)性。

1.2.3.3 糖醇類發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 通過菌株的糖醇類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)分離菌株對(duì)各種糖醇類碳源的利用情況。

1.2.3.4 耐鹽實(shí)驗(yàn) 將分離菌株接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，（35±0.2）℃下培養(yǎng)24h。吸取一定量菌株培養(yǎng)液接種到NaCl含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為0、3%、6%、9%、12%的MRS肉湯培養(yǎng)基中，（35±0.2）℃下培養(yǎng)48h，于650nm下測(cè)定OD值。

1.2.4 蛋白酶和脂肪酶活性實(shí)驗(yàn) 采用添加10%脫脂乳的MRS固體培養(yǎng)基，分別滴入0.2m L的菌液涂布均勻，（35±0.2）℃培養(yǎng)48h。若有透明圈出現(xiàn)，則可判定該菌株有分解蛋白質(zhì)的能力。采用添加10%豬油和中性紅指示劑的MRS固體培養(yǎng)基，分別滴入0.2m L的菌液涂布均勻，（35±0.2）℃培養(yǎng)48h。若有紅色斑點(diǎn)出現(xiàn)，則可判定該菌株有分解脂肪的能力。

1.2.5 優(yōu)勢(shì)乳酸菌24h的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸能力的測(cè)定 在MRS肉湯培養(yǎng)基中，分別接入經(jīng)活化過的分離菌株，在（35±0.2）℃下振蕩培養(yǎng)，用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)650nm處每隔4h測(cè)定其吸光度值（OD值），連續(xù)測(cè)定24h，以不接種的MRS肉湯培養(yǎng)基作為對(duì)照，并同時(shí)對(duì)應(yīng)測(cè)定其24h內(nèi)的pH的變化情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 中后期魚露發(fā)酵液中不同階段乳酸菌的分離鑒定

通過對(duì)兩年制魚露發(fā)酵液中后期不同階段乳酸菌的分離與鑒定，共分離獲得28種乳酸菌，其中有5種優(yōu)勢(shì)乳酸菌貫穿整個(gè)魚露發(fā)酵的中后期，分別編號(hào)為R1、R2、R3、R4、R5，其形態(tài)特征及菌體特征見表1與圖1。

圖1 5個(gè)分離菌株的菌體形態(tài)（1000×）Fig.1 Cellmorphology of five isolated strains（1000×）

由表1、圖1可以看出，中后期魚露發(fā)酵液中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌多數(shù)為白色，菌落表面濕潤(rùn)、光滑，邊緣整齊，均為革蘭氏陽(yáng)性菌；個(gè)體形態(tài)不盡相同，桿狀、假分枝狀和球狀。

2.2 乳酸菌的生理生化鑒定結(jié)果

乳酸菌的生理生化反應(yīng)與糖醇類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見表2和表3。5種乳酸菌的接觸酶實(shí)驗(yàn)均為陰性，不運(yùn)動(dòng)，不產(chǎn)H2S和吲哚，不液化明膠，可利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖和半乳糖。5種菌株都不能利用鼠李糖和山梨糖。相比較而言，R1、R4的耐鹽性要強(qiáng)于R2、R3、R5。

根據(jù)菌體和菌落形態(tài)、生理生化實(shí)驗(yàn)及糖醇類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)照《乳酸菌——生物學(xué)基礎(chǔ)及應(yīng)用》[8]、《乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[9]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[10]對(duì)菌株進(jìn)行鑒定分析。鑒定結(jié)果為：R1為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、R2為德氏乳桿菌乳亞種（L.delbrueckii subsp.lactis）、R4為短乳桿菌（L.brevis）、R5為乳酸乳球菌乳亞種（L.lactis subsp.lactis），而R3未能鑒別出種屬。

表2 5個(gè)分離菌株的生化特性Table2 Biochemistry characters of five isolated strains

表3 糖醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table3 Fermentation results of sugar and alcohol

2.3 乳酸菌對(duì)蛋白質(zhì)和脂肪能力的測(cè)定

表4 蛋白質(zhì)和脂肪降解活性Table4 Degradation activity of protein and fat

實(shí)驗(yàn)中對(duì)分離的5株乳酸菌對(duì)蛋白質(zhì)和脂肪的降解活性進(jìn)行了分析，其結(jié)果見表4。魚露發(fā)酵的中后期是其風(fēng)味形成的關(guān)鍵時(shí)期，發(fā)酵液中的乳酸菌如果具有蛋白質(zhì)酶和脂肪酶活性，則可能引起腐敗、出現(xiàn)酸敗味等現(xiàn)象[11-12]。從表4可知，所分離的R1、R2、R3、R4、R5均不具有蛋白質(zhì)酶活性和脂肪酶活性。

2.4 乳酸菌24h生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸能力的測(cè)定

由圖2可以看出，所分離的5種菌株在4h以后OD值明顯升高，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在培養(yǎng)16h后，OD值均達(dá)到較高水平，此后變化幅度趨于平穩(wěn)，說明菌種已進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期。乳酸菌在發(fā)酵液中產(chǎn)生大量的乳酸、乙酸等，提高了酸度，從而抑制其他雜菌的生長(zhǎng)，并能促進(jìn)魯氏酵母等一些增香酵母菌的繁殖和發(fā)酵[13-14]，從而與酵母菌共同作用，形成魚露特有的風(fēng)味。同時(shí)，產(chǎn)酸能力的大小也是衡量乳酸菌能否作為發(fā)酵劑的重要指標(biāo)之一。由圖3可見，5株乳酸菌分別在MRS肉湯培養(yǎng)基中的整體pH都呈下降趨勢(shì)，期間前4h下降較緩慢，此后，菌液的pH急劇下降，16h后pH變化較小。相對(duì)而言，R3、R5的產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，在培養(yǎng)24h后的pH為4.0左右。而R1、R4的產(chǎn)酸能力較弱，在培養(yǎng)24h后的pH為4.5左右。

圖2 菌液OD值隨時(shí)間變化曲線Fig.2 Changes in OD value of culturewith time

圖3 菌液pH隨培養(yǎng)時(shí)間變化曲線Fig.3 Changes in pH of culturewith time

3 結(jié)論

以發(fā)酵周期為兩年的傳統(tǒng)魚露發(fā)酵液為研究對(duì)象，分別對(duì)中后期不同階段（12、15、18、21、24個(gè)月）發(fā)酵液中的乳酸菌進(jìn)行篩選。共分離獲得28種乳酸菌，其中至少有5種優(yōu)勢(shì)乳酸菌貫穿整個(gè)發(fā)酵的中后期，分別是R1為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、R2為德氏乳桿菌乳亞種（L.delbrueckii subsp.lactis）、R4為短乳桿菌（L.brevis）、R5為乳酸乳球菌乳亞種（L.lactis subsp.lactis），R3未能鑒別出種屬。其中R1、R4的耐鹽性比較強(qiáng)，而R3、R5的產(chǎn)酸能力則相對(duì)較強(qiáng)。這5株乳酸菌均不具有對(duì)蛋白質(zhì)和脂肪的降解能力。該結(jié)果進(jìn)一步加深了對(duì)魚露發(fā)酵過程中乳酸菌種類、性質(zhì)的了解，為下一步探討多菌種發(fā)酵魚露提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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