超聲和水提法提取靈芝多糖的結(jié)構(gòu)和抗氧化性的比較研究

劉鈞發(fā)，馮夢(mèng)瑩，游麗君，*，羅 維，趙強(qiáng)忠，趙謀明

（1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640；2.華南理工大學(xué)分析測(cè)試中心，廣東廣州510640）

靈芝（Ganoderma lucidum）又稱芝草、神芝、靈芝草、仙草，屬于擔(dān)子菌門(mén)擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬。早在兩千年前就應(yīng)用于中醫(yī)，作為一種珍貴藥材，有很高的藥用價(jià)值。如《本草綱目》中記載，靈芝“甘溫?zé)o毒，主治耳聾，利關(guān)節(jié)，保神，益精氣，堅(jiān)筋骨，好顏色，療虛勞，治痔”。多糖是靈芝的主要活性成分，根據(jù)目前的研究，靈芝多糖主要具有抗癌，抗腫瘤，抗衰老，提高機(jī)體免疫力，降血糖等活性。如Liyan等[1]通過(guò)MTT方法研究靈芝多糖的GP-1和GP-2兩種純化組分，發(fā)現(xiàn)該兩種組分均能夠刺激巨噬細(xì)胞的增殖和胞飲能力，從而提高機(jī)體的免疫力。Chen等[2]通過(guò)對(duì)比正常小鼠，子房癌小鼠和經(jīng)靈芝多糖治療的子房癌小鼠的血清抗氧化酶的活性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)多糖治療的子房癌小鼠的MDA（丙二醛）的數(shù)量減少，血清抗氧化酶的活性提高，抑制子房癌細(xì)胞。

目前，靈芝多糖的提取方法主要有熱水提取法，酶解提取法，微波提取法以及超聲提取法。由于不同的提取方法，所得到的靈芝多糖的結(jié)構(gòu)以及活性都有所差異。因此，本研究通過(guò)采用超聲和傳統(tǒng)水提法制備靈芝多糖，對(duì)比兩種方法所得多糖的性質(zhì)差異，測(cè)定了得率、分子量、表面形態(tài)、單糖組成、抗氧化活性等，旨在為靈芝多糖的高效制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云南的赤靈芝子實(shí)體 由無(wú)限極（中國(guó)）有限公司提供；DPPH·、Trolox、FL及APPH· 購(gòu)于Sigma公司；其他試劑 均為分析純。

GL-21M型高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司；UV-2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 廣州市廣一科學(xué)儀器有限公司；KQ5800型超聲清洗器 東莞市科橋超聲波儀器有限公司；熒光酶標(biāo)儀Varioskan Flash 美國(guó)Thermo公司；Breeze高效凝膠滲透色譜儀 美國(guó)Waters公司；TDL-5-A型臺(tái)式飛鴿離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 先將靈芝子實(shí)體粉碎，得到的靈芝粉末再按料液比1∶6（w/v）的比例加入95%乙醇，在微沸的狀態(tài)下回流3h，除去色素及其他一些醇溶性雜質(zhì)。然后過(guò)濾，得到的濾渣置于烘箱中，把乙醇揮發(fā)干，得到的靈芝粉備用。

1.2.2 超聲提取靈芝多糖的制備 處理后的靈芝粉32g，并以蒸餾水為溶劑，按料液比1∶25，在超聲條件為480W，70℃，52m in，對(duì)靈芝進(jìn)行超聲提取。超聲的溶液進(jìn)行減壓抽濾，所得濾液在56℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮液中快速加入4倍體積的95%乙醇并不斷攪拌，在4℃冰箱下冷藏過(guò)夜后，于4800r/m in、20m in的條件下進(jìn)行離心，棄去上清液，取沉淀，將多余的乙醇揮干，用水復(fù)溶，即為超聲提取的靈芝多糖溶液。

1.2.3 水提靈芝多糖的制備 處理后的靈芝粉32g，并以蒸餾水為溶劑，按料液比1∶25，在100℃下回流2h，然后進(jìn)行減壓抽濾，所得濾渣，再按上述條件重復(fù)一次，所得兩次濾液合并，在56℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮液中快速加入4倍體積的95%乙醇并不斷攪拌，在4℃冰箱下冷藏過(guò)夜后，于4800r/min、20min的條件下進(jìn)行離心，棄去上清液，取沉淀，將多余的乙醇揮干，用水復(fù)溶，即為水提的靈芝多糖溶液。

1.2.4 多糖含量的測(cè)定 采用苯酚—硫酸法[3]來(lái)測(cè)定靈芝多糖的含量，并以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

多糖得率（%）=溶液中多糖含量（g）/原料質(zhì)量（g）×100

1.2.5 分子量的測(cè)定

1.2.5.1 色譜條件 色譜儀：Waters 1525，檢測(cè)器：Waters 2414，色譜柱：保護(hù)柱TSK-gel（PWXL6.0×40mm），TSKGEL 4000K凝膠柱（PWXL 7.8mm×300mm）和凝膠柱TSK-GEL2500K（PWXL7.8mm×300mm），流動(dòng)相：0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH=7.0），流速：0.6m L/m in，柱溫：35℃，注射容積：30L，運(yùn)行時(shí)間：35m in。

1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和樣品測(cè)定 將不同分子量的右旋糖酐（5200、11600、23800、48600、148000、273000、410000、668000、1400000u）相繼進(jìn)樣，測(cè)出其洗脫體積與分子量的對(duì)數(shù)關(guān)系，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。再根據(jù)樣品的洗脫體積和標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算分子量。

1.2.6 紅外分析 靈芝多糖水提和超聲提取的樣品紅外光譜分析參照Kumar等[4]的KBr壓片法。稱取2～4mg冷凍干燥后的多糖樣品，與已經(jīng)充分干燥的溴化鉀在研缽中充分研磨，壓片機(jī)壓成薄片。將薄片進(jìn)行紅外光譜掃描，掃描范圍為4000～400cm-1。

1.2.7 原子力顯微鏡（AFM）分析 參照孫潤(rùn)廣等[5]的方法，將凍干的水提和超聲提取的靈芝多糖，稀釋至0.01mg/m L，再吸取5～10μL于云母片上，吹干，使其固定于云母片上，再進(jìn)行AFM測(cè)定。

1.2.8 單糖組成的測(cè)定 通過(guò)氣相色譜進(jìn)行靈芝多糖單糖組成的分析，參考井澤良等[6]的文獻(xiàn)并略作修改。20mg的多糖樣品與5m L的4mol/L三氟乙酸（TFA）在100℃中水解2h。得到的水解液于55℃減壓旋干，再加入適量的甲醇繼續(xù)旋干，重復(fù)3～5次。再加入40mg的鹽酸羥胺、15mg內(nèi)標(biāo)肌醇和2m L的吡啶于90℃水浴振蕩30m in后，加入2m L醋酸酐繼續(xù)在90℃水浴振蕩30min。反應(yīng)后的溶液加入2m L水終止反應(yīng)后，加入4m L的二氯甲烷萃取，吸取上層的水，重復(fù)3次，最后加入無(wú)水硫酸鈉吸去剩余水分，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)后即可上樣。另外以D-葡萄糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖等標(biāo)準(zhǔn)物經(jīng)相同的條件處理，進(jìn)樣。

色譜條件為流動(dòng)相：100mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.0）-乙腈（體積比為80∶20），等度洗脫，流速1m L/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：245nm進(jìn)樣量：5μL；柱溫：室溫。

1.2.9 多糖抗氧化活性的測(cè)定

1.2.9.1 DPPH自由基的清除能力測(cè)定 DPPH自由基的清除能力是一種較為普遍的測(cè)抗氧化活性的方法。參考Wu等[7]的方法，并略作修改。2m L的靈芝多糖溶液（0.1～2.0mg/m L）與2m L的0.2mmol/L DPPH·溶液混合，振蕩，室溫下避光放置30m in，在517nm下測(cè)吸光值（Ai）。以2m L相同濃度的樣品和2m L無(wú)水乙醇混合作為對(duì)照組（A j），另外2m L DPPH·溶液和2m L無(wú)水乙醇混合后測(cè)吸光值（Ac）。

DPPH·清除率（%）=[1-（Ai-A j）/Ac]×100

1.2.9.2 還原力的測(cè)定 多糖還原力的測(cè)定主要參考You等[8]，并略作修改。2m L的多糖樣品（1～5mg/m L）與2m L的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.6）和2m L的鐵氰化鉀（1%，w/v）混合，在50℃水浴反應(yīng)20m in，然后加入2m L的三氯乙酸（10%，w/v）振蕩。取上清液2m L，并加入2m L的蒸餾水和0.4m L的氯化鐵振蕩，混勻，反應(yīng)10m in，在700nm下測(cè)吸光值，用蒸餾水調(diào)零。

1.2.9.3 氧自由基清除能力的測(cè)定 參照Wu等[9]的方法，并略作修改，20μL樣品與40μL 3.5nmol/L FL（熒光素鈉鹽）混合在37℃預(yù)熱15m in，然后加入140μL 12mmol/L的APPH·（自由基產(chǎn)生劑），通過(guò)酶標(biāo)儀在485nm下激發(fā)，538nm發(fā)射，每隔兩分鐘測(cè)一次吸光值并對(duì)吸光值的曲線進(jìn)行積分。再以Trolox（維生素E水溶性類(lèi)似物）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，將Trolox配成濃度分別為0、20、40、60、80、100、200μmol/L，再通過(guò)以上方法測(cè)出其凈面積，再以濃度為x軸，凈面積為y軸作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品測(cè)得的凈面積，代入Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得到樣品的Trolox當(dāng)量濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲提取和水提靈芝多糖得率的比較

超聲提取和水提靈芝多糖的得率如圖1所示，超聲提取靈芝多糖的得率為2.16%±0.03%，而水提靈芝多糖的得率為3.26%±0.03%。對(duì)于該品種的靈芝，傳統(tǒng)的水提方法能獲得更多的靈芝多糖，與其他文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]的情況有所差異，可能由于該品種靈芝受溫度的影響要大于超聲功率的影響，而由于水提方法溫度高，因此多糖更容易溶出，但具體的機(jī)理還有待以后深入研究。而且水提消耗的時(shí)間約是超聲提取方法的4倍。因此，從節(jié)能方面考慮，超聲提取方法的效率較高。

圖1 超聲提取和水提靈芝多糖的得率Fig.1 The yields of Ganoderma lucidum polysaccharides extracted by ultrasonic wave and hotwater

2.2 超聲提取和水提靈芝多糖分子量的分析

超聲提取和水提靈芝多糖的分子量分布如表1所示，從表1中可以看出，超聲方法提取的靈芝多糖分子量主要由兩部分組成，分別是19.5ku占23.56%和6.0ku占76.44%，而水提的靈芝多糖分子量則由三部分組分，分別是598.7ku占48.72%，18.6ku占20.91%和6.7ku占30.37%。與水提的靈芝多糖相比，經(jīng)超聲提取的靈芝多糖沒(méi)有檢測(cè)到分子量在598.7ku的組分，而6.0ku的組分比例升高明顯?？梢酝茰y(cè)，超聲提取時(shí)超聲波的作用對(duì)靈芝細(xì)胞的破碎程度明顯，導(dǎo)致部分大分子的多糖被破壞或者是更多小分子物質(zhì)溶出，從而降低了靈芝多糖的分子量。Chien等[12]通過(guò)比較不同分子量殼聚多糖的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)低分子量（12ku）的殼聚多糖比中分子量（95ku）和高分子量（318ku）的殼聚多糖要高。由于高分子量的多糖分子內(nèi)部氫鍵連接緊密，減弱了分子中羥基和活性基團(tuán)的活性，而低分子的多糖分子內(nèi)部的氫鍵連接相對(duì)較弱，分子中的羥基和活性基團(tuán)的活性較高，更有利于捕獲自由基，因此抗氧化能力較強(qiáng)。

2.3 超聲提取和水提靈芝多糖紅外的分析

為了進(jìn)一步確定超聲提取的靈芝多糖和水提的靈芝多糖結(jié)構(gòu)差異，分別對(duì)兩種多糖進(jìn)行紅外光譜的分析，結(jié)果如圖2所示。兩種靈芝多糖均在3410～3440cm-1之間具有較寬的吸收峰，為O-H的伸縮振動(dòng)，在2935cm-1附近具有弱吸收峰為烷基的C-H伸縮振動(dòng)，在1642cm-1附近可能是羧基的伸縮振動(dòng)，也有可能是結(jié)晶水特征峰，在1423cm-1和1382cm-1附近為-CH2的變形吸收峰。而在1200～1000cm-1附近水提的靈芝多糖的吸收峰強(qiáng)度要大于超聲提取的靈芝多糖，該區(qū)域?yàn)镃-O-C和C-O-H的吸收峰，在921cm-1附近的可能為D-葡萄糖特征吸收峰。說(shuō)明超聲法與水提法所得的靈芝多糖的基團(tuán)無(wú)顯著性差異，這與Yang等[13]的結(jié)論一致。

圖2 超聲提取和水提靈芝多糖的紅外光譜圖Fig.2 IR spectra of Ganoderma lucidum polysaccharides extracted by ultrasonic wave and hotwater

2.4 超聲提取和水提靈芝多糖AFM的分析

圖3 超聲提取和水提靈芝多糖的原子力顯微鏡圖Fig.3 AFM images of Ganoderma lucidum polysaccharides extracted by ultrasonic wave and hotwater

表1 超聲提取和水提靈芝多糖的分子量的組成（ku）Table1 Themolecularweights of Ganoderma lucidum polysaccharides extracted by ultrasonic wave and hotwater（ku）

圖3是在掃描范圍5.00μm×5.00μm的超聲提取和水提的靈芝多糖的原子力顯微鏡圖，通過(guò)比較超聲提取和水提靈芝多糖的平面圖可以發(fā)現(xiàn)，水提的靈芝多糖分子具有側(cè)枝結(jié)構(gòu)，分子中有很多分支連接，而經(jīng)超聲提取的多糖形狀發(fā)生明顯的變化，結(jié)構(gòu)較松散，呈現(xiàn)微小的圓顆粒狀，另外還有部分緊湊的聚合體，從超聲的三維圖更能清晰的看出，與其他單個(gè)多糖分子相比，其聚集成一定的高度的聚合物。主要是由于超聲的空穴作用，使大分子得到靈芝多糖離解成小分子，再由于超聲波的振動(dòng)使小分子相互聚集，形成形狀緊湊的聚合物。與Yang等[13]通過(guò)掃描電子顯微鏡的觀察多糖分子形態(tài)的結(jié)論相一致。超聲處理可讓多糖的解聚，分子量降低[14]。從圖3中可以看出，超聲處理后的靈芝多糖分子明顯要小于水提的靈芝多糖，這與本研究的分子量結(jié)論相一致。

表2 超聲提取和水提靈芝多糖的單糖組成Table2 Themonosaccharide composition of Ganoderma lucidum polysaccharides extracted by ultrasonic wave and hotwater

2.5 超聲提取和水提靈芝多糖單糖組成的分析

從表2可以看出，超聲提取的靈芝多糖和水提的靈芝多糖的主要由葡萄糖組成，摩爾百分比分別75.44%和79.39%，半乳糖和甘露糖也占有一定的比例。與Yi等[15]研究靈芝多糖的單糖組成為甘露糖，半乳糖，葡萄糖的摩爾比為1∶1.28∶4.91的結(jié)果相符合。另外本文還檢測(cè)含有少量的鼠李糖和巖藻糖，通過(guò)對(duì)比兩種方法得到的靈芝多糖，可以看出超聲提取對(duì)靈芝多糖的單糖組成影響不大。

2.6 超聲提取和水提靈芝多糖DPPH自由基清除能力

圖4 超聲提取和水提靈芝多糖的DPPH自由基清除能力Fig.4 DPPH radical scavenging activities ofGanoderma lucidum polysaccharides extracted by ultrasonic wave and hotwater

圖4為超聲提取和水提靈芝多糖的DPPH自由基清除能力。兩種方法提取的靈芝多糖的DPPH自由基清除率都隨著多糖濃度的增加而升高。在靈芝多糖濃度為0.5mg/m L時(shí)，超聲提取的靈芝多糖的DPPH自由基清除率達(dá)到79.90%±0.30%，是水提的靈芝多糖的1.3倍。從圖中可以看出，超聲提取靈芝多糖的DPPH自由基清除率要明顯高于水提靈芝多糖。Matthaus等[16]指出DPPH自由基的清除能力，主要是通過(guò)抗氧化劑提供的氫使DPPH自由基形成穩(wěn)定的分子，達(dá)到清除自由基的目的。經(jīng)超聲處理后的靈芝多糖，分子量降低，使得更多的活性基團(tuán)暴露出來(lái)，更容易捕獲DPPH自由基分子，因而超聲提取的靈芝多糖的DPPH自由基清除較強(qiáng)。這與Bao等[17]超聲提取能夠提高多糖的DPPH自由基清除能力的結(jié)果相一致。

2.7 超聲提取和水提靈芝多糖還原力

圖5 超聲提取和水提靈芝多糖的還原力Fig.5 The reducing power of Ganoderma lucidum polysaccharides extracted by ultrasonic wave and hotwater

還原力法的原理是抗氧化劑于50℃，能夠與鐵氰化鉀被還原成亞鐵氰化鉀，再與FeCl3反應(yīng)生成綠色的普魯士藍(lán)，在700nm下有強(qiáng)吸收峰[18]。因此抗氧化劑提供電子或者氫原子的能力越強(qiáng)，其還原力越強(qiáng)。圖5所示為超聲提取和水提靈芝多糖的還原力。兩種方法提取的靈芝多糖的還原力都隨著多糖濃度的增加而增加，且超聲提取靈芝多糖的還原力在0.9mg/m L多糖濃度時(shí)，達(dá)到1.035±0.001，而水提多糖的還原力只有0.661±0.005，即提高了約1.5倍。與DPPH自由基的清除能力結(jié)果一致。

2.8 超聲提取和水提靈芝多糖ORAC值

圖6 超聲提取和水提靈芝多糖的ORAC值Fig.6 The ORAC values ofGanoderma lucidum polysaccharides extracted by ultrasonic wave and hotwater

從圖6中可以看出，超聲提取靈芝多糖的ORAC值要顯著高于水提的靈芝多糖，超聲提取和水提靈芝多糖的ORAC值分別為2275.07±115.73、1260.51± 85.48μmol Trolox/g，超聲提取靈芝多糖是水提靈芝多糖的1.8倍。可見(jiàn)，超聲方法提取的靈芝多糖更有利于提高靈芝多糖的氧自由基清除能力，與DPPH自由基的清除能力和還原力的結(jié)果一致。

多糖的抗氧化活性與多糖的分子量、單糖組成，糖苷鍵連接、鏈構(gòu)象密切相關(guān)，本文研究其兩種不同提取方法的靈芝多糖，通過(guò)分子量、紅外光譜、AFM和單糖組成分析，發(fā)現(xiàn)超聲提取方法對(duì)靈芝多糖的單糖組成和官能團(tuán)的組成影響不大，但能夠明顯降低靈芝多糖的分子量，在AFM圖下靈芝多糖的分子形態(tài)也發(fā)生了明顯變化，結(jié)構(gòu)較為松散，增大了靈芝多糖與自由基的接觸面積，更容易捕捉到自由基，因此超聲提取靈芝多糖的DPPH自由基的清除能力、還原力、ORAC值均明顯高于水提靈芝多糖。影響超聲提取的靈芝多糖抗氧化能力還有其他的原因，如其溶解度，鏈構(gòu)象的變化等等，這還有待進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)論

通過(guò)研究超聲提取靈芝多糖和水提靈芝多糖，發(fā)現(xiàn)水提靈芝多糖的得率較高，但超聲提取靈芝多糖的DPPH自由基清除能力、還原力、ORAC值均明顯高于水提的靈芝多糖，分子量和多糖分子形態(tài)也明顯改變，另外單糖組成和紅外分析的結(jié)果變化不大。因此超聲提取靈芝多糖的抗氧化活性的提高可能與其分子量和結(jié)構(gòu)形態(tài)的改變有關(guān)，但其具體的機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。

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