康磚茶高效液相色譜指紋圖譜建立初探

胡 燕，齊桂年

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川雅安625014）

黑茶是我國的六大基本茶類之一，屬于后發(fā)酵茶，生產(chǎn)歷史悠久，主產(chǎn)區(qū)有四川、湖南、湖北、貴州、云南、廣西等省，是我國邊疆少數(shù)民族的日常生活必需品[1-2]。四川黑茶是我國黑茶類的一個重要組成部分，分為南路邊茶和西路邊茶，其中的南路邊茶主要包括康磚茶和金尖茶[3]?？荡u茶產(chǎn)于雅安，具有香氣純正，滋味尚濃醇，湯色紅褐、尚明，葉底棕褐稍花的品質(zhì)特點(diǎn)[4]。不同種類的茶葉由于加工方式不同，內(nèi)含化學(xué)成分差異明顯。組成康磚茶的原料復(fù)雜，經(jīng)過一系列的加工工序后，內(nèi)含物質(zhì)如多酚類、咖啡堿、茶色素等的種類和含量均會發(fā)生變化；同時，原料拼配比例的不同也會對康磚茶成品的質(zhì)量產(chǎn)生不同程度的影響；但目前對康磚茶質(zhì)量的評價仍主要是測定水分、總灰分、水浸出物等理化指標(biāo)并結(jié)合感官審評，難以全面反映其質(zhì)量。

化學(xué)指紋圖譜是一種從整體上研究復(fù)雜物質(zhì)體系的技術(shù)工具，目前已廣泛應(yīng)用于中藥的真?zhèn)舞b別、質(zhì)量控制、新藥開發(fā)等領(lǐng)域[5-6]，能全面反映物質(zhì)的整體化學(xué)特征，體現(xiàn)其內(nèi)在的整體質(zhì)量，但應(yīng)用于茶葉尤其是黑茶的研究較少[7-16]。本文采用雅安市八家康磚茶生產(chǎn)企業(yè)不同年份的共計(jì)48批康磚茶成品樣，優(yōu)化了色譜條件和樣品的提取條件，初步建立了康磚茶的HPLC指紋圖譜，為康磚茶的鑒別和全面質(zhì)量控制提供了一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)采用的康磚茶成品樣 取自2010～2012年四川省雅安市八家主要的康磚茶生產(chǎn)企業(yè)，每家企業(yè)每年取2個成品樣，連續(xù)取樣3年，共計(jì)48個樣品，樣品來源及出廠日期見表1；作為對照的甘露、黃芽、毛峰、茉莉花茶 產(chǎn)地均為雅安市；1個金尖茶成品樣 取自雅安市名山縣明陽茶廠；甲醇、乙腈 色譜純，美國Fisher公司；水 二次蒸餾水；無水乙醇、甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸 分析純，天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品 CAS號：58-08-2，購自中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

LC-20A高效液相色譜儀 配有在線真空脫氣裝置、四元泵、自動進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器，日本島津；LCsolution色譜工作站日本島津；超聲波清洗器 上海冠特超聲波儀器有限公司；電子天平 德國賽多利斯股份公司；臺式高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；電熱恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；微型植物實(shí)驗(yàn)粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 色譜條件

流動相A：0.3%甲酸水溶液；流動相B：乙腈。色譜柱：Zorbax SB-C18色譜柱（5μm，4.6mm×250mm）。檢測波長：190nm～400nm。柱溫：35℃。流速：1.0m L/m in。分析時間：45min。梯度洗脫程序：0～3min，2%B～5% B；3～5m in，5%B～12%B；5～10m in，12%B～16%B；10～16min，16%B～23%B；16～25min，23%B～26%B；25～35m in，26%B～30%B；35～40min，30%B～50%B；40～45m in，50%B～2%B。系統(tǒng)平衡色譜柱時間：15m in。

1.3 樣品前處理

稱取2.000g粉碎茶樣（康磚茶樣品先用茶刀敲碎后用微型植物實(shí)驗(yàn)粉碎機(jī)打成粉末，過40目篩）于250m L具塞錐形瓶中，加入90℃蒸餾水，立即移入90℃水浴中浸提15m in，每隔5m in搖動一次。浸提完畢后冷卻至室溫，離心15m in（轉(zhuǎn)速4000r/m in），取上清液用0.45μm水相濾膜過濾后上機(jī)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品的水提取物溶液在1.2的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，以19號峰（見圖6）為參照峰，HPLC圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.37%～1.21%和0.58%～1.76%，表明儀器的精密度良好。

2.1.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一康磚茶樣品5份，按1.3的前處理方法平行制備，在1.2的色譜條件下分別進(jìn)樣檢測，以19號峰為參照峰，測得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.83%～1.67%和0.79%～1.98%，表明該提取方法的重復(fù)性良好。

表1 康磚茶的樣品來源及出廠日期Table1 Sample source of kang zhuan tea and delivery date

2.1.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份康磚茶樣品，按1.3的前處理方法獲得水提取物溶液，分別在0、2、4、8、12、16、20、24h不同時間點(diǎn)，按1.2的條件進(jìn)樣檢測，測得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.93%～1.81%和1.03%～2.27%，表明樣品提取液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相的選擇 黑茶所含的化學(xué)成分復(fù)雜，在進(jìn)行HPLC分析時只有選擇合適的流動相才能提高樣品中各色譜峰的分離度，增強(qiáng)響應(yīng)值，降低基線噪聲。有研究表明，在酸性體系下可防止茶葉中兒茶素類的氧化[17]。該實(shí)驗(yàn)選用不同濃度的甲酸、乙酸、三氟乙酸和磷酸水溶液分別作流動相A；選用乙腈、甲醇分別作流動相B，采用不同比例進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明，當(dāng)選用0.3%甲酸水溶液作流動相A，乙腈作流動相B，并以1.2所示梯度進(jìn)行洗脫時樣品色譜峰的分離度較好，基線平穩(wěn)。

2.2.2 檢測波長的選擇 通過二極管陣列檢測器在190～400nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)檢測波長為230nm和280nm時色譜圖中出現(xiàn)的色譜峰數(shù)量較多，其中280nm波長處各色譜峰的分離良好且基線平穩(wěn)，因此在進(jìn)行指紋圖譜測定時選擇280nm作為檢測波長。

2.2.3 柱溫和流速的選擇 在其他實(shí)驗(yàn)條件不變的前提下，只改變色譜柱的溫度，柱溫分別設(shè)置為25、30、35、40℃。HPLC結(jié)果顯示，隨著柱溫的升高出峰時間稍有提前，但對色譜圖整體的出峰情況影響不大（圖1）。結(jié)合各主要色譜峰的分離情況綜合考慮，最終選擇柱溫為35℃。

圖1 康磚茶提取液在不同柱溫下的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of kang zhuan tea under different column temperature

在其他實(shí)驗(yàn)條件不變的前提下，只改變流動相的流速進(jìn)行梯度洗脫，流速分別設(shè)置為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8m L/min。HPLC結(jié)果顯示，當(dāng)流速較低時分析時間長，色譜峰變形和拖尾，分離度較低；隨著流速的提高，各色譜峰的出峰時間逐漸提前；當(dāng)流速為1.0m L/m in時，各色譜峰的分離度最好；之后隨著流速的繼續(xù)提高，柱壓升高，各色譜峰的分離度逐漸下降（圖2）。

2.2.4 梯度洗脫程序的選擇 康磚茶內(nèi)含成分復(fù)雜，不適合采用等度洗脫，該實(shí)驗(yàn)考察了不同的梯度洗脫程序?qū)荡u茶樣品各色譜峰分離度的影響。在充分保證基線穩(wěn)定、色譜峰能達(dá)到較好分離并且節(jié)省分析時間的前提下，最終選擇了1.2中所述的梯度洗脫程序進(jìn)行HPLC指紋圖譜測定。

圖2 不同流速下的HPLC圖Fig.2 The HPLC chromatograms under different flow velocity

2.3 樣品提取條件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇 選擇不同濃度的乙醇、甲醇、乙腈以及二次蒸餾水共16種溶劑對同一份康磚茶樣品進(jìn)行提取，不同提取溶劑所得色譜圖的總峰面積結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，用二次蒸餾水作為提取溶劑時所得色譜圖的總峰面積較大；同時，選用該溶劑提取康磚茶樣品時所得的色譜峰數(shù)目較多，用水浴提取也更符合飲茶習(xí)慣。

圖3 不同提取溶劑的總峰面積Fig.3 The total peak area of different solvents

2.3.2 料液比與提取時間的選擇 選取同一康磚茶樣品在90℃水浴中浸提15min，分別考察了1∶50、1∶70、1∶100、1∶150、1∶200的料液比對提取效果的影響；結(jié)果表明，在滿足良好分離度的前提下，當(dāng)料液比為1∶70時得到的色譜圖峰形好，色譜峰的響應(yīng)值較高?？疾炝颂崛r間（5、10、15、20、25、30、35、40、50、60min）對提取效果的影響；結(jié)果表明，當(dāng)浸提15m in時所得到的色譜峰數(shù)目較多，之后再延長浸提時間，某些色譜峰的響應(yīng)值反而略微降低，分析原因可能是隨著提取時間的延長，康磚茶中的某些化學(xué)成分發(fā)生了氧化分解。

2.4 康磚茶HPLC指紋圖譜的構(gòu)建

2.4.1 參照峰及共有峰的選擇 選擇出峰時間適中、與相鄰峰的分離度較好、峰面積在色譜圖中所占比例較大的19號峰作為參照峰。經(jīng)用咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液進(jìn)樣分析，確認(rèn)19號峰為咖啡堿。48批康磚茶成品樣的指紋圖譜見圖4。

圖4 48批康磚茶的HPLC指紋圖譜Fig.4 HPLC fingerprints of 48 batches of kang zhuan tea

將各色譜峰的保留時間與同一圖譜中參照峰的保留時間比較，其比值為各色譜峰的相對保留時間；各色譜峰按相對保留時間一一匹配后，選擇90%以上樣本共有的峰為樣本集的共有峰。該實(shí)驗(yàn)最終選擇了34個共有峰，各共有峰的平均相對保留時間見表2?；谟颜x茶廠的康磚茶（編號：S31）色譜峰總面積較大，峰數(shù)較多，將其指定為參比樣品，以求出其他樣品中各色譜峰i的相對峰面積Ar，其計(jì)算公式為Ar=（Ari/Ars）×100%，其中Ari為某樣品中某個色譜峰i的峰面積，Ars為參比樣品的總峰面積值。對八家企業(yè)康磚茶平均相對峰面積的聚類分析結(jié)果表明，當(dāng)臨界值為15時，八家企業(yè)的樣品聚為3類，友誼、朗賽、和龍和蔡龍的樣品聚為一類，義興藏茶單獨(dú)為一類，吉祥、周公山和雅安茶廠的樣品聚為一類（圖5）。對48批康磚茶的指紋圖譜進(jìn)行擬合，建立了對照指紋圖譜共有模式（圖6）。

圖5 八家生產(chǎn)企業(yè)康磚茶樣品的系統(tǒng)聚類分析圖Fig.5 Dendrogram of kang zhuan tea samples from eight production enterprises using cluster analysis

圖6 康磚茶HPLC指紋圖譜共有模式Fig.6 Common pattern simulated from HPLC fingerprints of kang zhuan tea samples

2.4.2 HPLC指紋圖譜的相似度評價 將48批康磚茶樣品的HPLC圖通過Lcsolution工作站以AIA格式導(dǎo)出，然后分別導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版）軟件中，先對同一企業(yè)不同生產(chǎn)年份的色譜圖進(jìn)行擬合，分別建立八個廠家指紋圖譜的共有模式，再以48批樣品的對照指紋圖譜共有模式為參照，對八家企業(yè)的指紋圖譜共有模式進(jìn)行相似度評價，從表3可知，八家企業(yè)的康磚茶指紋圖譜共有模式間的相似度在0.904～0.992之間，說明它們所含的化學(xué)成分極其相似，質(zhì)量較穩(wěn)定。而作為對照的甘露、黃芽、毛峰、茉莉花茶和金尖茶與康磚茶的相似度較低，說明不同原料和加工工藝對茶葉組分的影響較大。

3 結(jié)論

表2 48批康磚茶樣品共有峰的平均相對保留時間Table2 The average relative retention time of common peaks of 48 batches of kang zhuan tea samples

本實(shí)驗(yàn)利用優(yōu)化的色譜條件和樣品提取條件對雅安市八家主要康磚茶生產(chǎn)企業(yè)2010～2012年的共計(jì)48批康磚茶樣品進(jìn)行了HPLC指紋圖譜研究，確認(rèn)19號峰為咖啡堿，選擇其作為參照峰，建立了對照指紋圖譜共有模式。八家企業(yè)的康磚茶樣品與對照指紋圖譜共有模式的相似度在0.901～0.992之間，該結(jié)果表明八家不同企業(yè)的樣品中主要色譜峰的整體圖貌基本一致，說明質(zhì)量較穩(wěn)定。對八家企業(yè)康磚茶平均相對峰面積的聚類分析結(jié)果表明，當(dāng)臨界值為15時，八家企業(yè)的樣品可聚為3類。本實(shí)驗(yàn)所建立的HPLC指紋圖譜能在一定程度上為康磚茶質(zhì)量的客觀評價和控制提供科學(xué)依據(jù)。

表3 不同廠家康磚茶樣品的相似度Table3 The similarity of kang zhuan tea samples from different production enterprises

[1]胡紹德，陳暢暢，李大祥，等.黑茶中多酚組分和多酚總量分析[J].蠶桑茶葉通訊，2011（2）：26-28.

[2]楊崇仁，陳可可，張穎君.茶葉的分類與普洱茶的定義[J].茶葉科學(xué)技術(shù)，2006（2）：37-38.

[3]付潤華.康磚茶渥堆微生物及不同渥堆處理品質(zhì)成分變化的研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[4]吳錫端，駱少君，翁昆，等.緊壓茶康磚茶[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2002.

[5]陳菊.中藥HPLC指紋圖譜的研究進(jìn)展[J].新疆中醫(yī)藥，2008，26（2）：85-87.

[6]范驍輝，葉正良，程翼宇.基于信息融合的中藥多元色譜指紋圖譜相似性計(jì)算方法[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2006，27（1）：26-29.

[7]羅一帆，郭振飛，許旋，等.廣東嶺頭單樅茶高效液相色譜指紋圖譜的研究[J].食品科學(xué)，2005，26（4）：206-209.

[8]寧井銘，張正竹，谷勛剛，等.基于高效液相色譜的普洱曬青毛茶指紋圖譜識別方法[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2010，26（3）：243-248.

[9]Liang Zhang，Ning Li，Yan-Yun Che，etal.Development of the fingerprints of crude Pu-erh tea and ripened Pu-erh tea by high-performance liquid chromatography[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2011，20：352-359.

[10]王麗鴛，成浩，周健，等.基于多元化學(xué)批紋圖譜的武夷巖茶身份判別研究[J].茶葉科學(xué)，2010，30（2）：83-88.

[11]成浩，王麗鴛，周健，等.基于化學(xué)指紋圖譜的扁形茶產(chǎn)地判別分析研究[J].茶葉科學(xué)，2008，28（2）：83-88.

[12]王麗鴛，成浩，周健，等.綠茶數(shù)字化多元化學(xué)指紋圖譜建立初探[J].茶葉科學(xué)，2007，27（4）：335-342.

[13]王麗鴛，成浩，周健，等.普洱茶的HPLC化學(xué)指紋圖譜分類研究[J].浙江林業(yè)科技，2009，29（1）：25-30.

[14]陳林，陳鍵，張應(yīng)根，等.清香型烏龍茶品質(zhì)形成過程中兒茶素類和嘌呤堿指紋圖譜變化規(guī)律[J].茶葉科學(xué)，2011，31（6）：493-503.

[15]康海寧.茶葉化學(xué)組成分析方法及指紋圖譜研究[D].廈門：廈門大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006.

[16]高俊.黃山毛峰茶指紋圖譜的初步研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2008.

[17]康海寧，陳波，韓超，等.HPLC法測定茶葉水提液中五種兒茶素和咖啡堿及其用于茶葉分類的研究[J].分析測試學(xué)報(bào)，2007，26（2）：211-215.