高效液相色譜法快速檢測食品中18種合成色素

吳彥蕾，林曉洋，胡 靖，趙 博，朱永紅，*

（1.重慶市計量質(zhì)量檢測研究院食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究中心，國家農(nóng)副加工產(chǎn)品及調(diào)味品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，重慶市食品安全工程技術(shù)研究中心，重慶401123；2.重慶科技學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，重慶401331）

合成色素是采用化學(xué)合成的方法制備，大多是以苯、甲苯、萘等化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)過磺化、硝化、鹵化、偶氮化等一系列反應(yīng)合成而來，但由于成本低，著色力強，色澤鮮艷等特點被廣泛使用于食品加工生產(chǎn)過程中[1]。當(dāng)前食品中濫用合成色素的現(xiàn)象較為普遍，對食品中合成色素（包括食用合成色素和非食用合成色素）的檢測已成為各級食品檢驗機構(gòu)日常檢驗工作的重要內(nèi)容。由于食品中可能添加的合成色素種類較多，現(xiàn)有的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)已不能滿足實際檢測工作的需要。如國家標(biāo)準(zhǔn)方法《食品中合成著色劑的測定》[2]僅對檸檬黃、莧菜紅、日落黃等8種人工合成著色劑進行了測定，而且該方法前處理步驟較為繁瑣，用聚酰胺粉凈化雖然會排除一些干擾峰，但在很大程度上會造成目標(biāo)物質(zhì)的損失，且處理方法耗時長，不利于大批樣品的快速篩查；國家標(biāo)準(zhǔn)方法《食品中禁用物質(zhì)的檢測-堿性橙染料》[3]僅對堿性橙Ⅱ、堿性橙21、堿性橙22進行檢測；行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《進出口食品中羅丹明B的檢測方法》[4]僅對食品中的羅丹明B進行檢測；地方標(biāo)準(zhǔn)《食品和農(nóng)產(chǎn)品中多種堿性工業(yè)染料的測定》[5]僅對堿性橙、堿性嫩黃O及羅丹明B進行檢測等。因此，要同時開展多種合成色素的檢測，需要采用不同方法標(biāo)準(zhǔn)。

近年來，針對合成色素的高通量檢測方法已有較多報道[6-11]，但這些方法大多采用色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，且涉及的色素種類過多，并不太適合在日常檢測工作中使用。為了提高樣品分析有效性及針對性，本實驗將食品中常見的食用和非食用合成色素作為研究對象，通過對現(xiàn)有方法進行改進，建立一種采用HPLC法同時檢測食品中18種水溶性合成色素的方法，并對市場上部分有色食品進行了快速檢測，取得滿意結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品 購自于重慶市區(qū)超市、零售攤點及菜市場；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純） 購自美國TEDIA試劑公司；乙酸銨（分析純）、乙酸鉛（分析純） 購自成都市科龍化工試劑廠；檸檬黃（0.500mg/m L）、日落黃（0.500mg/m L）、莧菜紅（0.500mg/m L）、胭脂紅（0.500mg/m L）、亮藍（0.500mg/m L）、赤蘚紅（100mg/L）、誘惑紅（100mg/L） 購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；靛藍、羅丹明B、專利藍 購自Dr.Ehrenstorfer公司；堿性橙21、堿性嫩黃O、皂黃、堿性橙Ⅱ、酸性橙Ⅱ 購自Sigma A ldrich公司；喹啉黃、堿性橙22、偶氮玉紅 購自TCI公司。

戴安Ultimate 3000型高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器）、AL204電子天平（感量為0.0001g）梅特勒一托利多儀器（上海）有限公司；VORTEX GENIUS3型旋渦混合儀 德國IKA；SB-5200DT型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省余杭市榮華儀器制造有限公司；CF12RXⅡ型高速冷凍離心機日本HITACH I；Prouv型超低有機型純水器 德國Sartorius stedim。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

將18種色素用20%的甲醇溶液配制成質(zhì)量濃度均為100mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于4℃冰箱。將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液用20%甲醇依次稀釋成0.5、1.0、2.0、 5.0、10.0、20.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 高效液相色譜條件

色譜柱：Venusil MPC18柱（4.6mm×250mm，5μm）；柱溫：30℃；流動相：A為甲醇∶乙腈（1∶1），B為0.02mol/ L乙酸銨溶液；流速：1.0m L/m in；梯度洗脫程序：0～12.0min，5%A；12.0～30.0min，5%～35%A；30.0～35.0min，35%～98%A；35.0～35.1m in，98%～5%A；35.1～55m in；5%A。檢測器：二極管陣列檢測器，掃描范圍：200～800nm；進樣量：10μL。各對照品的檢測波長；檸檬黃、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、羅丹明B：254nm，喹啉黃、皂黃、堿性橙Ⅱ、堿性嫩黃O：400nm，誘惑紅、偶氮玉紅、赤蘚紅、酸性橙Ⅱ、堿性橙21、堿性橙22：500nm，亮藍、專利藍：600nm。

1.4 樣品處理方法

1.4.1 果汁、飲料 稱取5g（精確到0.01g）樣品，置于25m L比色管中（含二氧化碳的樣品在水浴鍋上加熱驅(qū)除二氧化碳），用20%的甲醇溶液定容至25m L。

1.4.2 糖果、醬腌菜類 稱取5g（精確到0.01g）樣品，置25m L比色管中，加入20%的甲醇溶液浸泡，置于水浴鍋中加熱，使其中色素充分溶解，最后用20%的甲醇溶液定容至25m L。

1.4.3 素食、糕點類 稱取5g（精確到0.01g）樣品，置25m L比色管中，加入20%的甲醇溶液浸泡，超聲30m in，使其中的色素充分溶解，最后用20%的甲醇溶液定容至25m L。

1.4.4 冰淇淋、牛奶類 稱取5g（精確到0.01g）樣品，置25m L比色管中，加入2m L左右的乙酸鉛溶液（22mg/m L），使其中的蛋白質(zhì)沉淀，靜置30m in，最后用20%的甲醇溶液定容至25m L。

取上清液轉(zhuǎn)入10m L離心管中，以10000r/m in離心5m in，用0.45μm聚四氟乙烯（PTFE）微孔濾膜過濾后供HPLC測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成色素檢測對象及分析方法的選擇

合成色素的種類眾多，為了提高檢測效率，建立一種能同時檢測多種合成色素的方法非常必要。如前所述，近年來針對合成色素的高通量檢測方法已有較多報道[6-11]。而這些方法中涉及的許多色素種類并未在食品中檢出過，而且這些方法大多采用了色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法，并不太適合在日常檢測工作中使用。本研究以食品中常見的合成色素作為檢測對象，以提高檢測的針對性，這些色素包括常見的食用合成色素和一些方法標(biāo)準(zhǔn)中所涉及的非食用合成色素。對于檢測方法，選擇基于紫外可見光檢測器的HPLC法，這也是目前食品檢測機構(gòu)最常用的食品中合成色素的檢測方法。

2.2 色譜條件的選擇

國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 5009.35中采用的流動相為0.02mol/L乙酸銨溶液與甲醇，本研究為了提高流動相對18種色素的洗脫能力，達到快速、有效分離，參考文獻[6]方法，將甲醇改進為甲醇∶乙腈（1∶1）進行梯度洗脫，最佳洗脫模式如1.3所述。各組分經(jīng)過C18色譜柱分離后，由二極管陣列檢測器掃描得紫外吸收光譜，各組分的最大吸收波長分為為：檸檬黃（258、427nm）、莧菜紅（216、520nm）、靛藍（288、600nm）、胭脂紅（215、509nm）、日落黃（236、480nm）、羅丹明B（259、547nm）、喹啉黃（414、432nm）、皂黃（417nm）、堿性橙Ⅱ（403nm）、堿性嫩黃O（435nm）、誘惑紅（508nm）、偶氮玉紅（518nm）、赤蘚紅（530nm）、酸性橙Ⅱ（484nm）、堿性橙21（489nm）、堿性橙22（494nm）、亮藍（628nm）、專利藍（634nm）。因此，確定18種組分的定量波長為：檸檬黃、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、羅丹明B在254nm處同時檢測，喹啉黃、皂黃、堿性橙Ⅱ、堿性嫩黃O在400nm處同時檢測，誘惑紅、偶氮玉紅、赤蘚紅、酸性橙Ⅱ、堿性橙21、堿性橙22在500nm處同時檢測，亮藍、專利藍在600nm處同時檢測。在優(yōu)化的條件下各組分得到了有效分離，圖1為18種色素的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖。

2.3 提取方法的確定

分別用純水、甲醇-水（2∶8）作為提取液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以純水提取樣品中色素時，堿性橙Ⅱ、堿性嫩黃O、偶氮玉紅、酸性橙Ⅱ、堿性橙21、堿性橙22這類保留時間較長的色素回收率較低，尤其是堿性橙22，空白樣品的加標(biāo)回收率僅為10%～20%。當(dāng)在提取液中加入20%的甲醇時，樣品中的色素提取較完全，能夠得到較為理想的加標(biāo)回收率（結(jié)果見表1）。此外，我們發(fā)現(xiàn)，微孔濾膜對回收率有較大影響?；羝G敏等[12]發(fā)現(xiàn)混合纖維素膜對赤蘚紅有較強吸附，樣品采用離心代替過濾，但對一些粘性較強的樣品，僅靠離心尚不足以對提取液進行有效地澄清，因此采取離心后過微孔濾膜的方式。觀察發(fā)現(xiàn)，常用的聚醚砜和尼龍濾膜對部分色素也有很強的吸附作用，其中赤蘚紅的加標(biāo)回收率僅為5%左右。本研究最后采取0.45μm PTFE濾膜過濾，取得較好的效果，這與文獻[11]報道一致。

2.4 線性范圍與檢出限

分別配制濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0mg/L的色素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化的檢測條件進樣分析，以峰面積Y對相應(yīng)的濃度X進行線性回歸，檢出限以3倍信噪比計算。各色素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及方法檢出限見表2。結(jié)果表明，18種色素在0.5～20.0mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性。相關(guān)系數(shù)r均大于0.9980，檢出限在0.06～3.75mg/kg之間。

2.5 回收率與精密度

在空白飲料樣品中分別添加各色素含量分別為3、15、40mg/kg三個水平的標(biāo)樣，按實驗方法測定，外標(biāo)法定量，平行測定6次，回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表1。結(jié)果顯示，色素添加量為3、15、40mg/kg時，18種色素的加標(biāo)回收率為68.9%～100.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.1%～5.3%，表明該方法精密度良好。

2.6 實際樣品分析

在優(yōu)化的條件下對目前重慶市場上的部分有色食品開展了快速篩查工作，樣品主要涉及果汁、飲料、糖果、醬腌菜、涼拌菜、冰淇淋等幾類。篩查結(jié)果顯示，目前市場上的有色食品中添加合成色素較為常見，所添加的色素均為食用色素，暫未發(fā)現(xiàn)非食用色素的非法添加行為。檢測發(fā)現(xiàn)，攤位零售的散裝果汁飲料（如西瓜汁、藍莓汁、芒果汁等）以及糖果類大多含有食用合成色素，包括檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍等6種。按照GB2760-2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對這幾種色素的限量規(guī)定，均未超標(biāo)。購自超市的榨菜和菜市場的散裝即食涼拌海白菜檢出檸檬黃超出0.1g/kg的限量值。此外，在少數(shù)呈現(xiàn)明顯綠色的即食涼拌蘿卜干和海白菜中檢出檸檬黃和亮藍。

圖1 18種合成色素的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.1 The standard chromatograms of 18 synthetic colors

3 結(jié)論

本文采用HPLC法建立了對18種常見食用色素與非食用色素的同時檢測方法，采用快速、簡便、通用的前處理方法與色譜條件，得到滿意的結(jié)果，適用于大批量樣品中多種食用色素和非食用色素的快速篩查，可為食品安全風(fēng)險監(jiān)測工作提供技術(shù)支持。

表1 空白飲料樣品中18種色素加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table1 Spiked recoveries and RSDs of 18 synthetic colours in blank samples

表2 18種色素的線性方程、相關(guān)系數(shù)與檢出限Table2 Linear equations and detection limits（LOD）of 18 synthetic colors

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