中藥沙苑子對運動性疲勞大鼠腦組織5-HT及其相關(guān)代謝物的影響

楊 瑾

1.College of Life Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China；2.Physical Education Department of Xi＇an University of Post and Telecommunications，Xi＇an 710061，China.

由于傳統(tǒng)觀念和測量方法的限制，對運動性疲勞的研究多集中于外周疲勞方面，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)在運動性疲勞中的作用卻少受重視。隨著新技術(shù)的應(yīng)用和神經(jīng)生物學研究的發(fā)展，運動性中樞疲勞愈來愈受到廣泛關(guān)注和研究。中樞疲勞發(fā)生部位起于大腦，止于脊髓運動神經(jīng)元。大腦皮層及皮層下中樞腦細胞工作強度下降可能是疲勞產(chǎn)生部位之一。腦細胞工作強度下降是大腦皮層保護性抑制發(fā)展的結(jié)果。運動時，大量沖動傳至皮層相應(yīng)神經(jīng)細胞，使之長期興奮，導致了消耗的增多，為避免過度消耗，當達到一定程度時就產(chǎn)生了保護性抑制。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)遞質(zhì)參與了這種疲勞的產(chǎn)生，也可以說是中樞疲勞產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)。5-HT作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，參與多種腦功能如情緒、疼痛、睡眠、體溫、內(nèi) 分 泌 等 的 調(diào) 節(jié)［19，21，25，31］。 近 年 來 ，5-HT 成 為 研 究 運 動性疲勞領(lǐng)域的熱點之一。諸多研究表明，長時間運動可使機體腦中5-HT水平增加，從而損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，降低中樞向外周發(fā)放神經(jīng)沖動，引起運動能力降低。運動性中樞疲勞對運動員正常訓練、比賽產(chǎn)生一定影響，如何推遲或消除疲勞顯得尤為重要。

運動性疲勞屬中醫(yī)“勞倦”范疇，中醫(yī)經(jīng)典著作中有許多對“疲勞”與“虛勞癥”的論述?！端貑柵e痛論》曰：“勞則氣耗”，《雜病廣要勞篇》曰：“勞動不息則形虛”，《景岳全書》曰：“凡虛損之由，無非勞倦七情飲食所致，或先傷其氣，氣傷必其精”，《金匱玉函要略輯文》曰：“勞則必勞其精血也”。中醫(yī)理論認為精（津）血為側(cè)力產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)，它的化生與運行與中醫(yī)脾、腎、肝、心有密切聯(lián)系，人的耐力亦由此而生。目前，應(yīng)用中藥運動補劑增強運動能力和消除疲勞的研究十分活躍，許多學者研究表明，中藥運動補劑對運動能力的提高和疲勞的消除有一定的作用。沙苑子（semen astragali complanati），為豆科植物扁莖黃芪（Astragalus complanatus R Br）干燥成熟的種子，在歷代本草中曾以白蒺藜、蒺藜子、潼蒺藜、沙苑蒺藜、大沙苑、沙蒺藜等名稱入藥，它是陜西特產(chǎn)中藥材之一［2，17］。醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，沙苑子富含多種氨基酸、多肽、黃酮類、蛋白質(zhì)，微量元素等成分，能夠溫補肝腎、固精、縮尿、益肝明目，具有一定的抗疲勞作用。本實驗試圖通過研究沙苑子對運動性疲勞大鼠海馬、間腦5-HT及其相關(guān)代謝物的影響，為沙苑子作為運動保健品的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

Sprague-Dawley（SD）雄性健康大鼠24只，3月齡，體重190～230g，由陜西中醫(yī)研究所實驗動物飼養(yǎng)中心提供，大鼠置于室溫22℃±5℃，相對濕度40%～65%清潔動物室中，分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.2 實驗模型的建立

1.2.1 動物分組及造模方法［10］

采用遞增強度的方式在國產(chǎn)電動鼠類跑臺（購自杭州）上跑臺運動，坡度為0。從訓練第1周起，每周遞增速度，分別為：15m／min，22m／min，27m／min，30m／min，35 m／min，每天訓練20min。第5周后按以下方案進行訓練：

一般訓練：于第6、7周每只大鼠每日按35m／min的速度，在跑臺上跑20min。

強化訓練：于第6、7周每只大鼠每日按35m／min的速度，在跑臺上跑30min。

造模期間于每周星期日測大鼠體重，造模周期共計7周，于第8周始取材，末次運動速度仍為35m／min，時間為30min。

實驗分組：

安靜對照組（6只）：自實驗開始第1～7周直至第8周取材日不進行任何運動訓練。

訓練對照組（6只）：進行5周的適應(yīng)訓練后，再進行2周的一般訓練，于第8周取材日運動后即刻取材。

強化訓練組（6只）：進行5周的適應(yīng)訓練后，再進行2周的強化訓練，于第8周取材日運動后即刻取材。

強化加藥組（6只）：進行5周的適應(yīng)訓練后，再進行2周的強化訓練，于第8周取材日運動后即刻取材。

1.2.2 給藥方法

強化訓練組大鼠每日于訓練后1h灌胃中藥（將沙苑子沖劑按比例溶解，按1.8g／kg的給藥劑量），沙苑子沖劑由陜西省恒心堂制藥有限公司生產(chǎn)，其余各組大鼠等體積的生理鹽水灌胃。

1.2.3 取樣

于取材日將大鼠乙醚麻醉，立即斷頭處死，切除延髓以下的脊髓部分，去除小腦和大腦皮層。前方以僵三角的前緣和視交叉為界，后方以四疊體前緣和乳頭體后緣為界離斷，分離出間腦和海馬。

1.2.4 樣品的制備

分別將稱重后的海馬、間腦組織于研缽中，加少許石英砂及80%乙醇3ml，研磨成漿，再加80%乙醇提取1h，過濾于蒸發(fā)皿中，將研缽和濾紙用80%乙醇（約5ml）洗2次。之后將濾液于75℃水浴上蒸干，并用pH2.20的檸檬酸緩沖液和10%偏磷酸按1∶1的比例溶解，高速離心，取上清液，低溫保存待用，測試Trp。

分別將稱重后的海馬、間腦組織于研缽中充分研磨，加0.4mmol／L高氯酸溶液1ml，之后將組織勻漿液轉(zhuǎn)入離心管，置冷凍離心機，4℃以10 000rpm離心15min；取上清，再轉(zhuǎn)入離心管，置冷凍離心機，4℃以10 000rpm離心10min；取上清并用0.4mmol／L高氯酸溶液定容至1 ml，混勻，低溫保存待用測試5-HTP、5-HT、5-HIAA含量。

1.3 主要試劑及儀器

5-HTP購自上?；瘜W試劑采購供應(yīng)站；5-HT、5-HIAA購自 Sigma公司；Trp、甲醇、HCl、Hac、NaAc、高氯酸均為色譜純，以及偏磷酸、檸檬酸緩沖液、石英砂、乙醇、茚三酮均購自西安化學試劑廠及上?；瘜W試劑廠。

Beckman 121MB氨基酸自動分析儀（美國）；HH系列恒溫浴鍋（深圳市沙頭角國華儀器廠）；TN-100托盤扭力天平（武漢自動化儀表廠）；Agilent 1100高效液相色譜（四元梯度泵，熒光檢測器，化學工作站）、電子天平（德國Sartorius）；冷凍離心機（美國Bechman）

1.4 測定分析條件

Trp測定：

樹脂：離子交換樹脂；緩沖液流速：10ml／h；茚三酮流速：5ml／h；進樣量：50μl；柱溫：54℃；層析柱：2.8mm×300mm；分析時間：65min；反應(yīng)水浴溫度：100℃；層析柱溫度：53℃；緩沖液壓力：4826～5515kPa；緩沖液pH：pH3.28；pH3.90；pH5.20。

5-HTP、5-HT、5-HIAA測定：

色譜條件：

色譜柱：Lichorsorb RP-C18（4.6×200mm，5μm）；流動相：0.1mmol／L NaAc（用 HAc調(diào)整pH 為5.10，內(nèi)含0.1 mmol／L EDTA –2Na）∶甲醇＝90∶10（V／V），流量為1.0 ml／min；柱溫：25℃；檢測波長：λex／λem＝290nm／330nm。

標準曲線：精密稱取5-HTP 2.30mg，5-HIAA 2.20mg，5-HT 1.93mg，分別置于10ml容量瓶，以0.1 mmol／L HCl溶解并調(diào)整至刻度，充分混勻。取此溶液1.25，2.50，5.00，7.50，10.0ml分別進樣測定，以含量（ng）對峰積作線性回歸。

回歸方程：

計算方法：含量（μg／g）＝ 測得值（ng）／ 進樣量（μl）×樣品總體積（ml）÷ 組織重量（g）。

2 結(jié)果

2.1 沙苑子及跑臺訓練對大鼠海馬5-HT及其相關(guān)代謝物質(zhì)的影響

表1結(jié)果顯示，一般訓練組大鼠海馬Trp、5-HTP、5-HT、5-HIAA含量均較安靜組高，但Trp、5-HTP、5-HIAA未顯示顯著性差異（P＞0.05），而5-HT含量極顯著高于安靜組（P＜0.01）；強化訓練組 Trp、5-HTP、5-HT、5-HIAA含量均高于安靜組和一般訓練組，且Trp含量較一般訓練組有極顯著性差異（P＜0.01）；5-HTP、5-HT含量較安靜組和一般訓練組均有極顯著性差異（P＜0.01），而5-HIAA未顯現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）；沙苑子可抑制 Trp、5-HTP、5-HT的升高，使強化加藥組大鼠海馬Trp、5-HTP、5-HT含量顯著低于強化訓練組，但5-HIAA含量顯著高于強化訓練組，幾種物質(zhì)均顯示出顯著性差異（P＜0.05）。

表1 本研究沙苑子及跑臺訓練對大鼠海馬5-HT及其代謝物的影響一覽表Table 1 Effects of Semen Astragali Complanati on 5-HT and Relevant Substances Levels of Hippocampus in Exercise-Induced Fatigue Rats

2.2 沙苑子及跑臺訓練對大鼠間腦5-HT及其相關(guān)代謝物質(zhì)的影響

表2結(jié)果顯示，一般訓練組大鼠間腦Trp、5-HTP、5-HT、5-HIAA含量均較安靜組高，其中5-HT含量較安靜組有顯著性差異（P＜0.05），其他并無顯著性差異（P＞0.05）；強化 訓練組 Trp、5-HTP、5-HT、5-HIAA 含量均高于安靜組和一般訓練組，且其中Trp含量顯著高于安靜組和一般訓練組，差異具有顯著性（P＜0.05），5-HT含量顯著高于安靜組和一般訓練組，差異具有極顯著性（P＜0.01），5-HTP含量與安靜組和一般訓練組相比，分別具有極顯著性和顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05）；沙苑子可抑制Trp、5-HTP、5-HT含量升高，且均具有顯著性差異（P＜0.05），而使5-HIAA含量高于強化訓練組，差異具有顯著性（P＜0.05）。

表2 本研究沙苑子及跑臺訓練對大鼠間腦5-HT及其代謝物的影響一覽表Table 2 Effects of Semen Astragali Complanati on 5-HT and Relevant Substances Levels of Diencephalon in Exercise-Induced Fatigue Rats

3 分析與討論

Newsholme于1986年首先提出，血漿中氨基酸含量的變化可影響腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)，尤其是5-HT的合成、堆積、釋放，從而在中樞疲勞中發(fā)揮作用［28］。5-HT是腦內(nèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，腦內(nèi)5-HT代謝變化與運動性中樞疲勞有關(guān)［18，22］。研究顯示，急性和持續(xù)性刺激可使腦區(qū)特定區(qū)域5-HT 含 量 發(fā) 生 改 變［23，26，30］，運 動 可 刺 激 腦 內(nèi) 某 些 區(qū)域神經(jīng)細胞釋放5-HT［24，27］。

血漿中5-HT并不能通過血腦屏障，因此，中樞5-HT只能在腦內(nèi)合成。正常情況下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，單胺類遞質(zhì)的代謝變化總處于相對平衡狀態(tài)，運動打破了這種平衡。f-Trp／BCAA的比值又會影響Trp入腦速度，運動使f-Trp／BCAA升高，通過血腦屏障的Trp增加，故腦合成5-HT增多，筆者前期研究結(jié)果也證實了這點［13］。運動時，腦組織能量消耗導致Na＋-K＋-ATP酶活性降低，于是神經(jīng)元去極化，促使神經(jīng)遞質(zhì)釋放增加，從而引起大量的5-HT釋放至細胞間隙。因此，腦組織細胞外5-HT蓄積，運動時間持續(xù)使這種蓄積持續(xù)，并使5-HT向周圍腦實質(zhì)、血管周圍彌散，5-HT與受體結(jié)合，發(fā)揮各種生理作用。

腦中Trp含量的多少直接關(guān)系著腦內(nèi)5-HT的生成。本實驗中長時間耐力訓練導致機體腦組織Trp水平的改變，隨著強度增大和時間的延長，Trp升高的幅度明顯加大。大量研究發(fā)現(xiàn)，血中游離Trp水平與腦內(nèi)Trp水平有高度一致性，本實驗結(jié)果支持這一觀點。進入腦組織中的Trp在TPH的作用下生成5-HTP后，很快便被5-羥色氨酸脫羧酶作用生成5-HT，對機體產(chǎn)生一定生理作用。實驗中Trp、5-HTP含量變化顯示，運動可使機體處于應(yīng)激狀態(tài)，Trp代謝顯著加強，尤其是在長時間大強度運動刺激后。腦組織中Trp的增多是由于運動使血中游離色氨酸增多的原因，5-HTP的增多可能是由于運動造成Trp生成5-HTP相關(guān)酶活性增加的緣故。

運動對腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響已有不少報道。Fujino等［20］用微透析技術(shù)在體檢測到游泳后大鼠前腦、海馬神經(jīng)細胞外5-HT水平提高。Pitsiladis等［29］檢測了人騎自行車疲勞后5-HT代謝加快，認為5-HT參與了運動性中樞疲勞的發(fā)生。實驗中慢性運動應(yīng)激可使海馬、間腦組織5-HT含量增加，導致運動疲勞的發(fā)生；大強度長時間運動使5-HT含量增加更為明顯，進而加重疲勞程度，支持以往觀點，5-HT活性增強可能通過多巴胺系統(tǒng)使覺醒和激動受抑，從而引起疲勞。學者研究表明，腦內(nèi)5-HT通過作用于各自的受體而發(fā)揮作用［11］。筆者發(fā)現(xiàn)，比較長時間較大強度運動應(yīng)激對大鼠腦組織5-HT生成作用更為明顯，可能通過以上途徑使疲勞程度更為加劇。5-HIAA作為5-HT的代謝產(chǎn)物，其腦內(nèi)水平的變化反映5-HT分解代謝的狀況。實驗大鼠海馬和間腦一般訓練組5-HIAA含量較安靜組高，但無顯著性差異；強化訓練組其含量高于安靜組和一般訓練組，未顯現(xiàn)顯著性差異，推測是由于多次重復運動刺激使大鼠對疲勞有了適應(yīng)性，同時運動作為一種應(yīng)激加速了5-HT的合成與降解。

依據(jù)中醫(yī)理論，應(yīng)用中藥對機體進行整體調(diào)節(jié)均能提高實驗動物的運動能力，對推遲和消除運動性疲勞起到積極作用［1，6，16］。醫(yī)學研究表明，依據(jù)不同癥候，運用中 藥 可使模型動物腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物發(fā)生變化。中醫(yī)理論認為，“腦為髓海”，腦的正常結(jié)構(gòu)依賴于心主神明，氣血流通，依賴于腎藏精生髓濡腦。研究表明，復方中藥“健憶液”［8］，“開 心 散”［3］可 使 模 型 大 鼠 腦 內(nèi) 5-HT 水平降低、5-HIAA水平增高。復方中藥“強身丹”［12］、“解百憂口服液”［14］，及溫腎陽中藥［4］均可對模型鼠腦內(nèi)5-HT、5-HIAA含量產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。

中醫(yī)認為，肝與運動性疲勞的發(fā)生有密切的關(guān)系。運動可以不同程度地影響肝臟組織細胞的結(jié)構(gòu)、功能及抗氧化能力。研究表明，力竭性運動訓練可導致血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著升高，對肝臟產(chǎn)生不良影響［15］。肝臟的功能主要為疏泄與藏血，尤以其疏泄功能為重要。運動性疲勞發(fā)生時，肝細胞結(jié)構(gòu)和功能會隨之發(fā)生改變。肝在運動中調(diào)節(jié)血糖水平，若肝失疏泄，運動時血糖的調(diào)節(jié)和丙酮酸循環(huán)代謝不足，容易導致疲勞過早出現(xiàn)?，F(xiàn)代醫(yī)學表明，肝臟功能與大腦皮層的興奮和抑制、植物神經(jīng)功能等多種因素關(guān)系密切。

本實驗中，強化加藥組大鼠海馬和間腦組織中Trp、5-HTP、5-HT均較強化訓練組有所下降，提示中藥沙苑子可通過抑制5-HT的合成前體，減少腦組織中5-HT的含量，而且沙苑子可使5-HIAA含量有所升高，說明其有效加速5-HT的分解，減少5-HT的積聚，使大鼠海馬和間腦5-HT水平對耐力運動反應(yīng)的敏感性降低，對其代謝過程、遞質(zhì)更新率及神經(jīng)元活性產(chǎn)生積極性影響，即可推遲運動疲勞的發(fā)生，又可及時消除疲勞。

究其原因，主要是由于沙苑子具有保肝作用［5，7］，肝臟的生理特性是主升發(fā)，喜調(diào)達而惡抑郁，通過調(diào)暢周身氣機，使氣機的升降出入運動協(xié)調(diào)平衡，從而維持各臟腑器官功能活動的正常。肝在調(diào)暢氣機的基礎(chǔ)上，還有疏通血脈、通調(diào)水道、疏泄膽汁、助脾胃運化、協(xié)調(diào)呼吸等功能。如果肝主疏泄的功能發(fā)生異常，還可進一步導致多種病理變化。所以古人有“百病生于氣”、“百病皆生于郁”之說。肝能協(xié)助及調(diào)節(jié)脾主運化的功能。加藥組補充沙苑子，減輕了大強度運動對肝臟所造成的不良影響，調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝，使大鼠海馬和間腦組織5-HT基礎(chǔ)水平降低，發(fā)揮推遲疲勞的作用。

筆者前期的研究結(jié)果顯示［13］，長時間耐力跑臺運動應(yīng)激使大鼠血清BCAA含量有所下降，AAA尤其是f-Trp含量上升，沙苑子可抑制BCAA下降、AAA上升趨勢；同時，長時間耐力跑臺運動使實驗大鼠血清f-Trp／BCAA、AAA／BCAA顯著增加，沙苑子對運動訓練引起的f-Trp／BCAA、AAA／BCAA升高有明顯的降低作用。由于沙苑子中含谷氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等多種氨基酸，可以減少AAA進入大腦的量，利于腦中AAA與BCAA間的平衡，進而影響進入機體中樞神經(jīng)Trp量，減少5-HT生成，延緩中樞神經(jīng)疲勞的發(fā)生程度。另外，沙苑子中含有的抗氧化成分對大腦的結(jié)構(gòu)有一定的保護作用［9］，可以使其對神經(jīng)遞質(zhì)含量引起變化的相關(guān)酶的活性及其基因發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，使5-HT的含量在補充沙苑子后有所下降，從而延緩中樞疲勞的發(fā)生。

4 結(jié)論

綜上所述，運動可使機體處于應(yīng)激狀態(tài)，Trp代謝顯著加強，5-HT含量顯著升高，尤其是在長時間大強度運動刺激后，中藥沙苑子可通過抑制5-HT的合成前體，減少腦組織中5-HT的含量，而且可以有效加速5-HT的分解，減少5-HT的積聚，既可推遲運動疲勞的發(fā)生，又可及時消除疲勞。

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