吐溫對(duì)不同精粗比底物體外發(fā)酵特性的影響

■李 林陳 勇

（1.新疆科技開發(fā)交流中心，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)新疆肉乳用草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830052）

如何提高反芻動(dòng)物對(duì)粗飼料的利用對(duì)于提高反芻家畜的生產(chǎn)效率具有重要意義。研究表明，表面活性劑具有提高纖維降解的作用(Chun等，2003；Jo?han等,2003)，吐溫是表面活性劑的一種，是通過山梨醇與不同的脂肪酸酯化生成的多聚化合物，主要包括山梨醇酐單月桂酸酯(吐溫20)、山梨醇酐單棕櫚酸酯(吐溫40)、聚氧乙烯山梨醇酐單硬脂酸酯(吐溫60)、聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯(吐溫80)。對(duì)吐溫80的研究表明，它的作用主要表現(xiàn)在促進(jìn)纖維素的水解、改變厭養(yǎng)真菌細(xì)胞膜的流動(dòng)性(Reese等，1969)、促進(jìn)真菌和細(xì)菌的生長(zhǎng)、加快秸稈的發(fā)酵速度(Wang等，2003)，這表明，吐溫80可能是一種值得開發(fā)的新型反芻動(dòng)物飼料添加劑，但是目前對(duì)吐溫20、吐溫40、吐溫60的研究還未見報(bào)道，而且這4種吐溫對(duì)不同精粗比發(fā)酵底物的研究也未見報(bào)道。因此，吐溫20、吐溫40、吐溫60對(duì)不同精粗比發(fā)酵底物在人工瘤胃中發(fā)酵的影響有助于認(rèn)識(shí)其對(duì)瘤胃發(fā)酵調(diào)控的作用，闡明其是否具有作為反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵調(diào)控劑的潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用隨機(jī)單位組試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)分為3種不同精粗比的發(fā)酵底物，底物組成見表1。

表1 不同精粗比的發(fā)酵底物組成（g DM/瓶）

每種發(fā)酵底物分別添加吐溫20、40、60或80，使終濃度為0.2%。對(duì)照組不添加任何吐溫。每種發(fā)酵底物設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

1.2 人工唾液的配制

人工唾液的配制根據(jù)McDougall（1948）的配方配制，配好后再通入CO2使溶液澄清備用。

1.3 綿羊混合瘤胃液的制備

選用裝有永久性瘤胃瘺管的羯羊4只，自由采食玉米秸稈，補(bǔ)飼精料200 g/(d·只)。于晨飼前用過瘤胃瘺管采集瘤胃內(nèi)容物500 g/只左右，瘤胃液用四層紗布過濾于保溫瓶中，混勻，在39℃下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.4 體外培養(yǎng)方法與樣品采集

根據(jù)表1準(zhǔn)確稱取發(fā)酵底物于125 ml培養(yǎng)瓶中，再量取50 ml過綿羊混合瘤胃液和50 ml人工唾液。輕輕混勻后，用橡膠塞密封培養(yǎng)瓶，置39℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。體外培養(yǎng)采用許琴（2002）的方法，分別在培養(yǎng)后的3、6、9 h搖勻測(cè)pH值，并采樣10 ml，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

取出于-20℃保存的樣品，室溫解凍后用于測(cè)定還原糖、氨態(tài)氮、微生物蛋白。還原糖測(cè)定采用吳遜等（2001）的方法、氨態(tài)氮測(cè)定采用馮宗慈等（1993）的方法，微生物蛋白測(cè)定采用Makkar等（1981）的方法。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。統(tǒng)計(jì)分析采用DPS5.02軟件（唐啟義等，2002）中的“隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分析”進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 吐溫對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)液中pH值的影響(見表2)

表2 吐溫對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)液中pH值的影響

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各組的pH值均呈現(xiàn)不同程度的下降。當(dāng)發(fā)酵底物的精粗比為15∶85和30∶70時(shí)，添加吐溫對(duì)發(fā)酵后的3 h和6 h均無顯著影響，在發(fā)酵后的9 h，吐溫20組的pH值顯著高于對(duì)照組，吐溫40組僅當(dāng)精粗比為15∶85時(shí)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。但3個(gè)吐溫組間無顯著差異。當(dāng)精粗比為45∶55時(shí)，添加吐溫對(duì)發(fā)酵后3、6、9 h的pH值均無顯著影響。

2.2 吐溫對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)液中還原糖濃度的影響（見表3）

表3 吐溫對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)還原糖濃度的影響(μg/ml)

當(dāng)精粗比為15∶85時(shí)，添加吐溫對(duì)培養(yǎng)后3 h的還原糖水平無顯著影響，在培養(yǎng)后6 h時(shí)吐溫40組的還原糖水平最高，顯著高于對(duì)照組、吐溫20組和吐溫60組(P＜0.05)，在培養(yǎng)后9 h時(shí)，添加吐溫組的還原糖水平均較對(duì)照組有不同程度的下降，其中吐溫80組的還原糖水平顯著低于對(duì)照組和吐溫60組（P＜0.05）。當(dāng)精粗比為30∶70時(shí)，吐溫60組的還原糖水平在培養(yǎng)后的3 h和6 h均最高，并顯著高于對(duì)照組和吐溫20組(P＜0.05)。在培養(yǎng)后9 h時(shí)，吐溫40組的還原糖水平最高，并顯著高于吐溫20組(P＜0.05)。當(dāng)精粗比為45∶55時(shí)，對(duì)照組的還原糖水平在培養(yǎng)后的3 h和6 h均最高，其中3 h時(shí)，對(duì)照組顯著高于吐溫20組(P＜0.05)。在培養(yǎng)后6 h和9 h時(shí)，各組間還原糖水平無顯著差異。由此可見，吐溫40最高可提高還原糖濃度為45.68%（P＜0.05，精粗比1中的 6 h），吐溫60最高可提高25.65%（P＜0.05，精粗比2中的3 h），吐溫80最高可提高28.70%（精粗比1的6 h），而吐溫20對(duì)各時(shí)間點(diǎn)還原糖濃度均無顯著影響。

2.3 吐溫在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)氨態(tài)氮濃度的影響(見表4)

表4 吐溫對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)氨態(tài)氮濃度的影響(mg/100 ml)

當(dāng)發(fā)酵底物的精粗比為15∶85時(shí)，在發(fā)酵后的3 h和6 h添加吐溫均增加培養(yǎng)液中的氨態(tài)氮水平，其中吐溫80組和吐溫20組的氨態(tài)氮水平分別在3 h和6 h顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，在9 h時(shí)，各組間的氨態(tài)氮水平無顯著差異。當(dāng)精粗比為30∶70時(shí)，在培養(yǎng)后的3 h和 6 h時(shí)，各組間的氨態(tài)氮均無顯著性差異，在9 h時(shí)，添加吐溫組均高于對(duì)照組，其中吐溫20組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。當(dāng)精粗比為45∶55時(shí)，在培養(yǎng)后3 h時(shí)，各組間的氨態(tài)氮也無顯著差異，但培養(yǎng)后6 h時(shí)，吐溫20組、吐溫60組和吐溫80組的氨態(tài)氮水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），到培養(yǎng)后9 h時(shí)，吐溫80組的氨態(tài)氮水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。綜上，吐溫20最高可提高氨態(tài)氮濃度為16.05%（P＜0.05，精粗比1中的6 h），吐溫40最高可提高8.15%（精粗比3的9 h），吐溫60最高可提高7.02%（精粗比1的3 h），吐溫80最高可提高11.20%（P＜0.05，精粗比1的3 h）。

2.4 吐溫在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)微生物蛋白水平的影響（見表5）

表5 吐溫對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)微生物蛋白水平的影響(mg/ml)

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物蛋白水平總體呈增加趨勢(shì)。在培養(yǎng)初期，無論底物精粗比如何，添加吐溫對(duì)微生物蛋白水平均無顯著影響。當(dāng)精粗比為15∶85和30∶70時(shí)，培養(yǎng)后6 h的微生物蛋白水平均以對(duì)照組最高，并分別顯著高于吐溫20組以及吐溫80組（P＜0.05）。在培養(yǎng)9 h時(shí)，添加吐溫對(duì)精粗比為15∶85的底物產(chǎn)微生物無顯著影響；當(dāng)精粗比為30∶70時(shí)，吐溫80組顯著高于吐溫60組，其它各組間無顯著差異；當(dāng)精粗比為45∶55時(shí)，吐溫60組顯著低于對(duì)照組和吐溫80組（P＜0.05）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，吐溫80能促進(jìn)瘤胃厭氧真菌和部分細(xì)菌的生長(zhǎng)、刺激纖維素降解酶的釋放、抑制酶活性下降、增加酶活性、促進(jìn)底物與酶的附著(Re?ese，196；Chun等，2004；Johan等，2004)。在體外培養(yǎng)條件下，吐溫80和吐溫20對(duì)棉花秸稈的降解具有顯著的促進(jìn)作用(陳勇等，2005、2006)，并且其最佳添加水平為0.2%。有關(guān)吐溫在不同精粗比條件下對(duì)體外瘤胃發(fā)酵的影響還未見報(bào)道。

瘤胃pH值是瘤胃發(fā)酵的重要指標(biāo)，對(duì)于粗飼料的消化有重要影響。一般情況下，瘤胃pH值為6.2～6.8。纖維分解菌對(duì)于pH值的變化比較敏感，當(dāng)pH值較低時(shí)，其活性會(huì)受到影響，使粗飼料的消化率下降，瘤胃pH值的降低還使瘤胃微生物區(qū)系受到影響，從而抑制纖維素的分解（刁其玉等，2004）。本試驗(yàn)中，培養(yǎng)基中的pH值水平在6.4～6.8之間，均處于有利于纖維降解的范圍內(nèi)。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各組的pH值均呈現(xiàn)不同程度的下降。在發(fā)酵后期，吐溫20和吐溫40在低精粗比條件下有增加pH值的作用。

Lee等（2003）發(fā)現(xiàn)，添加吐溫80顯著提高胞外羧甲基纖維素酶（CMCase）和木聚糖酶活力（P＜0.01)，顯著降低胞內(nèi)羧甲基纖維素酶和木聚糖酶活力(P＜0.01)，其它胞外酶如蛋白酶、淀粉酶和大麥葡聚糖酶活性也顯著提高（P＜0.01)。但是，Hris?tov等（2000）報(bào)道，在動(dòng)物試驗(yàn)中吐溫對(duì)瘤胃羧甲基纖維素酶、木聚糖酶和淀粉酶沒有顯著影響（P＞0.05）。當(dāng)瘤胃中羧甲基纖維素酶和木聚糖酶活力提高后，必然導(dǎo)致培養(yǎng)液中還原糖水平的升高。在本試驗(yàn)中雖然沒有對(duì)培養(yǎng)基中的酶活力進(jìn)行研究，但是從還原糖水平看，吐溫40和吐溫60在培養(yǎng)前期可增加還原糖水平，表明這兩種吐溫對(duì)酶活力具有增強(qiáng)作用。有關(guān)吐溫40和吐溫60對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響還鮮見報(bào)道。在本研究中吐溫對(duì)體外發(fā)酵中還原糖產(chǎn)生不顯著，這與已有的報(bào)道不同。這種差異可能是由于添加劑的劑量、孵育時(shí)間和動(dòng)物種類不同等原因造成的。

在本試驗(yàn)中，添加吐溫有增加氨態(tài)氮濃度的作用。這與Lee等（2003）的報(bào)道相似。氨態(tài)氮濃度的升高預(yù)示著灌注非離子表面活性劑能使更多的植物性蛋白在瘤胃內(nèi)降解。這可能與吐溫可增加瘤胃蛋白酶活力有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，吐溫80顯著刺激非纖維菌菌株的生長(zhǎng)速度，同時(shí)最有效濃度為0.05%。吐溫80也可促進(jìn)纖維分解菌的生長(zhǎng)，但0.1%的效果優(yōu)于0.05%的效果。因此，添加吐溫80刺激非纖維分解菌生長(zhǎng)的效果要好于纖維分解菌（Lee等，2003）。在本研究中，從微生物蛋白水平看，添加吐溫均沒有表現(xiàn)出促進(jìn)瘤胃微生物生長(zhǎng)，相反在大多數(shù)時(shí)間里，添加吐溫組的微生物蛋白水平均低于對(duì)照組，這可能與添加水平有關(guān)。吐溫作為表面活性劑，具有增強(qiáng)微生物細(xì)胞膜流動(dòng)性的作用，在高濃度條件下，可破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)受阻。

4 結(jié)論

在不同精粗比底物條件下，添加吐溫的作用不同。吐溫通過提高瘤胃氨態(tài)氮和還原糖水平調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵。