HPLC法測(cè)玉米蛋白粉和乳豬教槽料中色氨酸的含量

■宋吉英

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東青島 266109）

色氨酸又名α-氨基-β-吲哚丙酸，有DL-、D-和L-色氨酸三種異構(gòu)體，天然存在的只有L-色氨酸，通常是仔豬日糧繼賴氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸后的第四限制性氨基酸。研究表明，色氨酸可以調(diào)節(jié)動(dòng)物肝臟蛋白質(zhì)的合成[1]，可以提高動(dòng)物大腦中5-羥色胺的濃度，提高仔豬采食量，與攝食低色氨酸濃度的日糧相比，攝食高色氨酸濃度日糧的仔豬將表現(xiàn)出較好的生長(zhǎng)性能[2]。目前，對(duì)色氨酸的測(cè)定，多采用不同濃度、不同種類強(qiáng)堿水解樣品，再用比色法、熒光法等方法定量[3-5]，本文重點(diǎn)探討用HPLC法測(cè)定有代表性的飼料原料和配合飼料。

本文選取飼料原料中的玉米蛋白粉和配合飼料中的乳豬教槽料，來(lái)考察用HPLC法測(cè)定色氨酸的含量。玉米蛋白粉是經(jīng)醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)淀粉或釀酒工業(yè)提純后的副產(chǎn)品，其蛋白營(yíng)養(yǎng)成分可達(dá)60%以上，是飼料工業(yè)中常用的蛋白原料。教槽料俗稱補(bǔ)料或者開(kāi)口料，是指乳豬出生7 d后到斷奶后7～10 d內(nèi)使用的特殊飼料[6-7]，其中原料的添加需重點(diǎn)考慮豬的消化率、適口性和可消化氨基酸的平穩(wěn)，因此需要添加一些優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物或植物蛋白。以上兩種材料經(jīng)堿水解后均可得到一定含量的色氨酸，是測(cè)定色氨酸含量比較有代表性的飼料原料和配合飼料。

1 儀器與試劑材料

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀（配有Agi?lent1260系列二極管陣列檢測(cè)器DAD），K241R型低溫高速離心機(jī)，UVIKON XS型紫外分光光度計(jì)，GZX-9240MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱，KQ-600DE數(shù)控超聲波清洗器，Lab860型臺(tái)式酸度計(jì)，氮?dú)馄?，聚四氟乙烯螺紋口瓶。

1.2 試劑與溶液

甲醇(色譜純)，超純水(用前過(guò)0.45 μm濾膜)，4 mol/l氫氧化鋰溶液（一水合氫氧化鋰16.78 g，用水溶解并定容到100 ml容量瓶中），6 mol/l鹽酸溶液（將優(yōu)級(jí)純鹽酸與水等體積混合），0.008 5 mol/l乙酸鈉溶液（0.56 g無(wú)水乙酸鈉溶于800 ml水中，再用乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.0，用0.45 μm濾膜過(guò)濾），L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（準(zhǔn)確稱取色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品2.98 mg，用上述乙酸鈉溶液溶解，并定容到10 ml容量瓶中）。

1.3 材料

玉米蛋白粉和乳豬教槽料均來(lái)自于市購(gòu)，烘干后粉碎，置于磨口瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的前處理方法

稱取1.000 0 g待測(cè)飼料試樣，置于50 ml聚四氟乙烯螺紋口瓶中，加15 ml、4 mol/l氫氧化鋰溶液，置于碎冰中冷凍，并通氮?dú)? min，擰緊瓶蓋，并用封口膜封瓶。將封好的聚四氟乙烯瓶放入(110±1)℃的干燥箱中，水解24 h。取出水解瓶，冷卻至室溫，開(kāi)瓶，加入大約10 ml，6 mol/l的鹽酸中和，置于冰浴中緩慢滴加鹽酸，調(diào)節(jié)pH值在6左右，然后，上機(jī)用0.008 5 mol/l乙酸鈉溶液將水解液定量的轉(zhuǎn)移到100 ml容量瓶中定容。搖勻，靜置后取部分上清液于高速離心機(jī)中離心，離心后所得上清液過(guò)0.45 μm濾膜，然后封口置于冰箱中，供上機(jī)測(cè)定使用。

2.2 最佳吸收波長(zhǎng)的選擇

為了確定色氨酸的最佳紫外吸收波長(zhǎng)，用紫外分光光度計(jì)在200～400 nm波長(zhǎng)范圍下掃描，得到如圖1所示的掃描光譜，表明色氨酸在222 nm和279 nm波長(zhǎng)條件下有較強(qiáng)的吸收，為了避免溶劑或其他雜質(zhì)的干擾，所以本文選擇280 nm作為色氨酸的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 色譜條件的選擇

色譜柱：Agilent C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：0.008 5 mol/l乙酸鈉溶液+甲醇=95+5；進(jìn)樣量20 μl。在以上色譜條件下進(jìn)行上機(jī)分析測(cè)定，得到的色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品譜圖和兩種飼料樣品譜圖如圖2、圖3、圖4所示，色氨酸的出峰時(shí)間在13 min左右。

圖1 色氨酸在200～400 nm波長(zhǎng)下的掃描光譜

圖3 玉米蛋白粉樣品色譜

圖4 乳豬教槽料樣品色譜

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取2 ml L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，采用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋法配成一系列不同濃度的L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在2.3節(jié)的色譜條件下進(jìn)行分析。得到的譜圖以濃度c為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5所示，回歸方程為：A=30.891 7c-0.562 8，結(jié)果表明，色氨酸在4.646～298 mg/ml范圍內(nèi)，峰面積與其濃度線性關(guān)系良好(r=0.999 9)，計(jì)算得檢出限為0.033 5 mg/ml。

圖5 色氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.5 前處理方法的精密度考察

分別取玉米蛋白粉和乳豬教槽料三份平行樣進(jìn)行前處理，處理后的樣品按2.3節(jié)的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，得到三份玉米蛋白粉中色氨酸的平均含量為0.331%，測(cè)定量RSD值為3.67%；三份乳豬教槽料中色氨酸的平均含量為0.268%，測(cè)定量RSD值為0.94%。結(jié)果表明，前處理方法的精密度良好，該前處理方法適合飼料中色氨酸的測(cè)定。

2.6 檢測(cè)方法的精密度考察

將玉米蛋白粉和乳豬教槽料經(jīng)處理后的上機(jī)待測(cè)樣品分別在高效液相色譜上連續(xù)進(jìn)樣5次，按2.3節(jié)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。玉米蛋白粉中色氨酸的平均含量為0.345%，測(cè)定量RSD值為0.640%；乳豬教槽料中色氨酸的平均含量為0.266%，測(cè)得量RSD值為0.471%。結(jié)果表明，用高效液相色譜法測(cè)定色氨酸的含量具有良好的精密度。

2.7 空白加標(biāo)回收

準(zhǔn)確稱取3份1.00 g不含氨基酸的飼料載體，各加入100 ml色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用同樣的前處理方法進(jìn)行處理，用2.3節(jié)的色譜條件檢測(cè)，結(jié)果（見(jiàn)表1）表明，平均回收率為99.04%，加入的色氨酸基本沒(méi)有損失，該前處理方法準(zhǔn)確、可靠。

表1 空白加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

3 小結(jié)

本文建立了用高效液相色譜法測(cè)定玉米蛋白粉和乳豬教槽料中色氨酸的試驗(yàn)方法。本方法樣品前處理將國(guó)標(biāo)上的聚四氟乙烯襯管換成聚四氟乙烯螺紋口瓶，操作簡(jiǎn)單，色譜條件容易掌握，大大縮短了試驗(yàn)時(shí)間。方法的精密度和空白回收率都較高，完全可以滿足分析要求，是測(cè)定飼料原料和配合飼料中色氨酸含量的可行有效的方法。