一株凝結(jié)芽孢桿菌芽孢抗逆性研究及其產(chǎn)孢條件優(yōu)化

■余 岳王春維祝愛俠 李 濤

（1.武漢工業(yè)學(xué)院動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023；2.武漢市畜禽飼料工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430023）

乳酸菌是葡萄糖或乳糖在發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱，絕大多數(shù)乳酸菌能調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道功能紊亂和維系內(nèi)源微生態(tài)系統(tǒng)平衡，具有相當(dāng)重要的生理功能[1]。然而傳統(tǒng)的乳酸菌（如保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌等）不能生成芽孢，對高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及膽鹽的耐受性較差，經(jīng)制粒、膨化等加工過程制備成微生態(tài)飼料制劑并飼喂動(dòng)物后能到達(dá)腸道的活菌數(shù)相對較少。

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）屬于硬（或厚）壁菌門腸道乳酸菌，是一類可產(chǎn)芽孢的特殊乳酸菌[2]。除了具有傳統(tǒng)乳酸菌可調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道健康、提高消化能力和提高免疫力等作用外，其芽孢狀態(tài)對環(huán)境具有相當(dāng)?shù)目鼓嫘?，對高溫、胃酸和膽鹽都有一定的耐受能力[3]。1992年該菌種被美國食品與藥物管理局（FDA）和美國飼料控制官員協(xié)會(huì)列入可用于飼料的安全菌株名單中[4]。芽孢體是凝結(jié)芽孢桿菌區(qū)別于傳統(tǒng)乳酸菌的關(guān)鍵所在，也是制備微生態(tài)飼料制劑的理想形態(tài)[5]。本試驗(yàn)旨在研究實(shí)驗(yàn)室保藏的一株凝結(jié)芽孢桿菌BCRC11592對高溫、強(qiáng)酸、膽鹽的耐受能力及其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長抑制能力，并利用搖瓶液體發(fā)酵，優(yōu)化凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)孢率的培養(yǎng)條件，為微生態(tài)飼料制劑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種：凝結(jié)芽孢桿菌BCRC11592為本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，牛肉浸出粉3 g，氯化鈉5 g，水1 000 ml（固體培養(yǎng)基另添加15 g瓊脂）；調(diào)pH值為7.0，121℃滅菌20 min后冷卻至室溫。

發(fā)酵培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，牛肉浸出粉3 g，氯化鈉5 g，葡萄糖6.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，K2HPO42.0 g，MnSO4·H2O 50 mg，水 1 000 ml；調(diào) pH 值為7.0，121℃滅菌20 min后冷卻至室溫。

稀釋液：添加0.1%吐溫80的蒸餾水，121℃滅菌20 min后冷卻至室溫。

1.2 方法

1.2.1 活化菌株

將保存的菌株劃線接種到種子固體斜面培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2 種子菌液制備

挑取純化培養(yǎng)的菌落于種子液體培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)液制備

將凝結(jié)芽孢桿菌種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

1.2.4 測定方法

①活菌數(shù)測定：以傾注法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)[6]。

②芽孢數(shù)測定：將培養(yǎng)菌液置于80℃水浴加熱10 min以充分滅活營養(yǎng)體菌體細(xì)胞，再以傾注法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)[7]。

③產(chǎn)孢率公式

產(chǎn)孢率（%）=(芽孢數(shù)/活菌數(shù))×100

2 結(jié)果與分析

2.1 抗逆性及抑菌性能試驗(yàn)

2.1.1 溫度對凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)和存活率的影響

參考顆粒飼料制備過程中調(diào)質(zhì)和造粒的具體時(shí)間和溫度[8]，設(shè)定試驗(yàn)溫度分別為60、70、80、90、100℃，試驗(yàn)時(shí)間均為10 min。吸取凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液100 μl于裝有900 μl無菌水的離心管中，在不同溫度下水浴加熱10 min后，適度稀釋，測定活菌數(shù)，以常溫下的發(fā)酵培養(yǎng)液作為空白對照，計(jì)算凝結(jié)芽孢桿菌的存活率。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，下同。結(jié)果見圖1。

圖1 溫度對凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)和存活率的影響

從圖1可以看出，該凝結(jié)芽孢桿菌具有優(yōu)秀的耐高溫能力，在90℃和100℃的高溫下處理10 min后存活率分別為81.9%和79.6%。

2.1.2 酸處理對凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)和存活率的影響

根據(jù)動(dòng)物胃液pH值特點(diǎn)以及食糜在胃部停留時(shí)間，試驗(yàn)選取pH=2為耐受點(diǎn)，耐受時(shí)間分別為0.5、1、2、3和4 h[9]。吸取凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液100 μl于裝有900 μl、pH=2的稀釋液的離心管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)0.5、1、2、3和4 h后，適度稀釋，測定活菌數(shù)，以pH=7的稀釋液作為空白對照，計(jì)算凝結(jié)芽孢桿菌的存活率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酸處理對凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)和存活率的影響

圖2結(jié)果表明，該凝結(jié)芽孢桿菌在pH=2.0的環(huán)境中保留4 h后的存活率仍超過了50%，具有優(yōu)秀的耐酸能力。

2.1.3 膽鹽對凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)和存活率的影響

根據(jù)動(dòng)物腸道環(huán)境及食糜消化特點(diǎn)，試驗(yàn)選取膽鹽濃度0.3%為耐受點(diǎn)，耐受時(shí)間分別為1、2、4、6、8 h[10]。吸取凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液100 μl于裝有900 μl豬膽鹽濃度為0.3%的稀釋液的離心管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)1、2、4、6、8 h后，適度稀釋，測定活菌數(shù)，以未添加豬膽鹽的稀釋液作為空白對照，計(jì)算凝結(jié)芽孢桿菌的存活率，結(jié)果見圖3。

圖3 膽鹽對凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)和存活率的影響

圖3結(jié)果表明，該凝結(jié)芽孢桿菌對膽鹽的耐受能力很強(qiáng)，在0.3%的膽鹽環(huán)境中8 h后的存活率可達(dá)79.4%。

2.1.4 抑菌試驗(yàn)

采用大腸桿菌CCRC10306和金黃色葡萄球菌CCRC1780為指標(biāo)菌株進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。將指標(biāo)菌用種子培養(yǎng)基37℃恒溫培養(yǎng)36 h后，分別涂板、干燥，在培養(yǎng)基上打出直徑為8 mm的孔洞。然后將凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)3 000 r/min離心5 min后，吸取上清液100 μl注入孔洞內(nèi)，37℃培養(yǎng)24 h，測量其抑菌圈大小[12]。并與普通保加利亞乳桿菌對比抑菌能力，結(jié)果見表1。

表1 抑菌試驗(yàn)結(jié)果（mm）

表1結(jié)果顯示，該凝結(jié)芽孢桿菌對兩種革蘭氏陰性菌的生長有不同程度的抑制作用。與傳統(tǒng)保加利亞乳桿菌相比，在對金黃色葡萄球菌的生長抑制方面性能稍弱，而對大腸桿菌生長抑制方面性能接近。

2.2 不同培養(yǎng)條件對其菌體生長和產(chǎn)孢率的影響在對該菌株抗逆性及其對革蘭氏陰性菌生長

抑制能力的研究基礎(chǔ)上，研究不同培養(yǎng)條件對其菌體生長和產(chǎn)孢率的影響。起始培養(yǎng)條件為pH值7.0，培養(yǎng)溫度37℃，接種量105cfu（稀釋種子菌液至105cfu/ml，移取1 000 μl至發(fā)酵培養(yǎng)基中），搖床轉(zhuǎn)速180 r/min。

2.2.1 菌株生長曲線測定

用FP-1100-C型全自動(dòng)生長曲線分析儀（芬蘭OY Growth Curves公司生產(chǎn)）測定該菌株的生長曲線，以確定其初步生長特性。吸取凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液200 μl于蜂窩板孔中，設(shè)置培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，“快速”轉(zhuǎn)速檔培養(yǎng)，于600 nm處每小時(shí)測定一次吸光值，結(jié)果如圖4所示。

圖4 菌株生長曲線

圖4顯示，該菌株培養(yǎng)0～4 h時(shí)處于生長調(diào)整期，活菌數(shù)相對較少；在5～12 h處于生長對數(shù)期，微生物以對數(shù)方式增殖，生長速度最快；12～33 h處于穩(wěn)定期，活菌數(shù)在較高的范圍保持穩(wěn)定，新生和死亡達(dá)到平衡狀態(tài)；33 h后處于衰亡期，微生物由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和自身副產(chǎn)物的積累而不斷消亡，活菌數(shù)逐漸減少。

2.2.2 培養(yǎng)時(shí)間對其菌體生長和產(chǎn)孢率的影響

根據(jù)該菌株生長曲線顯示，培養(yǎng)于12 h時(shí)進(jìn)入菌體生長穩(wěn)定期。試驗(yàn)設(shè)定培養(yǎng)時(shí)間分別為6、12、24、36、48 h。在不同培養(yǎng)時(shí)間后測定凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)和芽孢數(shù)，并計(jì)算其產(chǎn)孢率，結(jié)果見圖5。

圖5顯示，活菌數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間延長先增大后減少，在12 h達(dá)到最大，而芽孢數(shù)在24 h最大，以最大芽孢數(shù)為優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)，選用24 h為最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間。

2.2.3 初始pH值對其菌體生長和產(chǎn)孢率的影響

試驗(yàn)設(shè)定液體培養(yǎng)基初始pH值分別為5.5、6、6.5、7、7.5。測定不同初始pH值條件下凝結(jié)芽孢桿菌的活菌數(shù)和芽孢數(shù)，并計(jì)算其產(chǎn)孢率，結(jié)果見圖6。

圖6顯示，活菌數(shù)在pH=7時(shí)達(dá)到最大，但在此條件下產(chǎn)孢率較低導(dǎo)致芽孢數(shù)不高，而在pH=6.5時(shí)能獲得最大芽孢數(shù)，故選用初始pH=6.5為最佳pH值。

圖5 培養(yǎng)時(shí)間對其菌體生長和產(chǎn)孢率的影響

圖6 初始pH值對其菌體生長和產(chǎn)孢率的影響

2.2.4 培養(yǎng)溫度對其菌體生長和產(chǎn)孢率的影響

試驗(yàn)設(shè)定培養(yǎng)溫度分別為 25、30、37、40、45℃，測定在不同培養(yǎng)溫度條件下凝結(jié)芽孢桿菌的活菌數(shù)和芽孢數(shù)，并計(jì)算其產(chǎn)孢率，結(jié)果見圖7。

圖7 培養(yǎng)溫度對其菌體生長和產(chǎn)孢率的影響

圖7結(jié)果表明，該菌株在37℃時(shí)活菌數(shù)較高，但產(chǎn)孢率低下，在40℃時(shí)有較高的活菌數(shù)和產(chǎn)孢率，能獲得最大芽孢數(shù)，故本試驗(yàn)選用40℃為最佳培養(yǎng)溫度。

2.2.5 接種量對其菌體生長和產(chǎn)孢率的影響

試驗(yàn)分別設(shè)定接種量為103、104、105、106、107cfu。測定不同接種量下凝結(jié)芽孢桿菌的活菌數(shù)和芽孢數(shù)，并計(jì)算其產(chǎn)孢率，結(jié)果見圖8。

圖8 接種量對其菌體生長和產(chǎn)孢率的影響

圖8結(jié)果表明，當(dāng)接種量為104cfu時(shí)產(chǎn)孢率最大，但活菌數(shù)不高。接種量為106cfu時(shí)能獲得最大芽孢數(shù)，故本試驗(yàn)選用106cfu為最佳接種量。

2.2.6 搖床轉(zhuǎn)速對其菌體生長和產(chǎn)孢率的影響

分別測定搖床轉(zhuǎn)速在 120、140、160、180、200 r/min條件下發(fā)酵后凝結(jié)芽孢桿菌的活菌數(shù)和芽孢數(shù)，并計(jì)算其產(chǎn)孢率，結(jié)果見圖9。

圖9 搖床轉(zhuǎn)速對其菌體生長和產(chǎn)孢率的影響

圖9結(jié)果表明，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min時(shí)，凝結(jié)芽孢桿菌生成的芽孢數(shù)多于其他轉(zhuǎn)速，故本試驗(yàn)選用140 r/min為最佳搖床轉(zhuǎn)速。

2.3 討論

2.3.1 抗逆性和抑菌性能分析

本試驗(yàn)證明了凝結(jié)芽孢桿菌BCRC11592具有優(yōu)秀的抗逆性能，而這種抗逆能力則與其本身能生成的芽孢體相關(guān)，這也應(yīng)證了國外之前某些研究的結(jié)果[12]。芽孢是某些細(xì)菌在停止生長時(shí)產(chǎn)生的休眠體，具有獨(dú)特而復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。其低水性的構(gòu)造和極低的新陳代謝作用使其在抗熱、抗化學(xué)物質(zhì)、抗輻射和抗靜水壓等方面有很好的表現(xiàn)[13]。該凝結(jié)芽孢桿菌在耐高溫方面的特性可以保證其在顆粒飼料制備過程中能保持高水平活菌數(shù)；同時(shí)在飼喂應(yīng)用中，其對強(qiáng)酸和膽鹽環(huán)境的耐受能力則能保證在胃液和腸液中的穩(wěn)定性，從而能有足夠的活菌數(shù)以發(fā)揮益生效用。而抑菌試驗(yàn)表明該凝結(jié)芽孢桿菌對兩種革蘭氏陰性菌的生長有一定的抑制作用。抑菌作用機(jī)制一般包括益生菌體分泌有機(jī)酸以降低腸道環(huán)境的pH值，與其它微生物競爭環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)，降低氧化還原電位，產(chǎn)生過氧化氫以及產(chǎn)生特定的抑菌素等[14]。該凝結(jié)芽孢桿菌的抑菌作用屬于哪種機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，不過可以肯定其具有改善腸道微生態(tài)環(huán)境的能力。綜合以上結(jié)論，該菌株具備開發(fā)為微生態(tài)飼料制劑的潛力。

2.3.2 產(chǎn)孢條件優(yōu)化結(jié)果分析

凝結(jié)芽孢桿菌為兼性厭氧菌，其所需的生長環(huán)境相對較寬松。但由于芽孢體往往在環(huán)境惡劣、營養(yǎng)缺乏的條件下生成，以抵御不良的外界因素。因此較適宜的溫度、pH值和較高搖床轉(zhuǎn)速能帶來更高的活菌數(shù)，但是不利于其芽孢體的生成。而過于惡劣的溫度、pH值以及過低的轉(zhuǎn)速則會(huì)影響菌體的正常生長，菌體濃度過低，同樣不利于高芽孢數(shù)的獲得[15]。根據(jù)該菌體的生長曲線可知，其在12 h可達(dá)到菌體生長穩(wěn)定期，具有最高的菌體濃度，而芽孢體往往形成于菌體生長后期，本試驗(yàn)優(yōu)化后的24 h培養(yǎng)時(shí)間與該結(jié)論相吻合。

本試驗(yàn)通過搖瓶培養(yǎng)獲得最大芽孢數(shù)為3.0×108cfu/ml，而進(jìn)行發(fā)酵罐擴(kuò)大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)可能會(huì)有不同結(jié)果，此方面問題尚待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，可得出以下結(jié)論：

①該凝結(jié)芽孢桿菌具有優(yōu)秀的抗逆性能，且這種抗逆能力與其本身能生成的芽孢體相關(guān)。

②該凝結(jié)芽孢桿菌對兩種革蘭氏陰性菌的生長有一定的抑制作用。

③該凝結(jié)芽孢桿菌的最佳產(chǎn)孢條件為培養(yǎng)時(shí)間24 h、培養(yǎng)溫度40℃、初始pH值為6.5、接種量為106cfu和搖床轉(zhuǎn)數(shù)為140 r/min，在此條件下菌液活菌數(shù)為3.5×108cfu/ml，芽孢數(shù)為3.0×108cfu/ml，產(chǎn)孢率為85.7%