有效檢測發(fā)酵豆粕中抗原蛋白的新方法

■王 寅 王希輝 張克順

（1.山東省計量科學(xué)研究院，山東濟(jì)南 250014；2.青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司，山東青島 266700）

發(fā)酵豆粕作為優(yōu)質(zhì)的植物蛋白原料，因具有合理的氨基酸組成，適口性好，養(yǎng)分利用率高而被廣泛地應(yīng)用在畜牧養(yǎng)殖中。但其存在較多的抗?fàn)I養(yǎng)因子，如抗原蛋白、胰蛋白酶抑制劑、脲酶等。而抗原蛋白的危害最為嚴(yán)重，它會引起仔豬發(fā)生過敏性腹瀉，腸黏膜細(xì)胞增生等一系列不良反應(yīng)，甚至造成死亡[1]。因此抗原蛋白含量高低成為評判發(fā)酵豆粕品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

目前測定抗原蛋白的方法主要有SDSPAGE、高效液相色譜法和ELISA法[2]。但由于加工工藝不同，高溫會使發(fā)酵豆粕表層蛋白變性，發(fā)生美拉德反應(yīng)[3]，使用Tris-HCl等常規(guī)提取液[4]不能將被變性蛋白包裹的抗原蛋白提取出來，因此使用SDS-PAGE、高效液相色譜、ELISA等檢測獲得抗原蛋白量并不能說明發(fā)酵豆粕中抗原蛋白的真實(shí)水平。我們通過多次試驗(yàn)對比和探索，最終選擇用0.6%的KOH[5]處理發(fā)酵豆粕樣品，可有效提取可溶性蛋白，且提取量大致相當(dāng)，將提取的上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并用Gelanalyzer軟件對電泳圖進(jìn)行蛋白質(zhì)條帶分析，得出抗原蛋白占總可溶性蛋白百分含量，依此來判斷發(fā)酵豆粕中抗原蛋白的降解程度。

1 材料與方法

1.1 材料

豆粕：樣品1（烘干進(jìn)風(fēng)溫度300℃）、樣品2（烘干進(jìn)風(fēng)溫度240℃）、樣品3（烘干進(jìn)風(fēng)溫度140℃）均為國內(nèi)某公司發(fā)酵豆粕產(chǎn)品，未發(fā)酵生豆粕。

儀器：磁力攪拌器，粉碎機(jī)，分光光度計，酶標(biāo)儀，蛋白質(zhì)電泳儀，分析天平，樣品篩。

試劑：pH值8.0的0.03 M Tris-HCl（含0.03 M β-巰基乙醇），0.2%、0.4%、0.6%的氫氧化鉀溶液，SDS-PAGE電泳所用試劑，抗原蛋白定量測定試劑盒（ELISA法），Bradford法所用試劑。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

取需要檢測的發(fā)酵豆粕樣品，用四分法縮減分取200 g左右，粉碎過0.25 mm孔徑的樣品篩，充分混勻，裝入磨口瓶中備用[5]。

1.2.2 試驗(yàn)步驟

1.2.2.1 樣品Tris-HCl處理后SDS-PAGE電泳

為檢驗(yàn)Tris-HCl對發(fā)酵豆粕樣品中抗原蛋白的提取效率，試驗(yàn)取樣品1.000 0 g加入50 ml 0.03 M Tris-HCl樣品處理液，放在磁力攪拌器（200 r/min）上攪拌 60 min，以 2 700 r/min離心10 min。取上清液100 μl，加100 μl 2×上樣緩沖液，搖勻，沸水浴5～10 min，處理液進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.2.2 抗原蛋白定量測定試劑盒（ELISA法）測抗原蛋白

為驗(yàn)證ELISA法對發(fā)酵豆粕樣品中抗原蛋白的檢測效果，試驗(yàn)選擇國產(chǎn)抗原蛋白定量試劑盒對大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白進(jìn)行定量檢測，方法按試劑盒說明書。

1.2.2.3 樣品氫氧化鉀溶液處理后SDS-PAGE電泳

為有效提取出可溶性蛋白，試驗(yàn)選擇提取率較好的氫氧化鉀，提取液進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳分析，方法為：稱取大豆粕試樣1.0 g，精確到0.1 mg,置于250 ml高型燒杯中，加人0.2%、0.4%、0.6%氫氧化鉀溶液50.00 ml，放在磁力攪拌器（200 r/min）上攪拌60 min。將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，以2 700 r/min離心10 min，取上清液100 μl，加100 μl 2×上樣緩沖液，搖勻，沸水浴5～10 min，處理液進(jìn)行SDSPAGE電泳。同時用Bradford法[6]測定處理上清液中可溶性蛋白含量，以確定能溶解可溶性蛋白量大致相近的合適氫氧化鉀溶液濃度。將確定的氫氧化鉀溶液濃度的處理樣品上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.2.4 Gelanalyzer軟件對蛋白質(zhì)凝膠圖片進(jìn)行抗原蛋白分析

取以上已確定的氫氧化鉀溶液濃度的處理樣品上清液所獲得的SDS-PAGE電泳圖，使用Gelanalyzer軟件選擇某一泳道的全部區(qū)域，計算整個區(qū)域的光密度值，然后根據(jù)光強(qiáng)度選擇α'、α、β、acid、base亞基蛋白條帶，計算出各亞基的光密度值，并計算各亞基抗原蛋白所占總可溶性蛋白的百分比?？乖鞍渍伎偪扇苄缘鞍椎谋壤降?，說明發(fā)酵豆粕中抗原蛋白被降解得越好。

2 結(jié)果

2.1 樣品Tris-HCl處理后SDS-PAGE電泳

用0.03 M Tris-HCl樣品處理液處理發(fā)酵豆粕，離心獲得的上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，加樣量為10 μl。由電泳圖可知（圖1），樣品3抗原蛋白條帶較明顯，樣品2次之，樣品1抗原蛋白條帶最淡最少。實(shí)際上用Tris-HCl樣品處理液處理的上清中抗原蛋白含量差異較大，對如干燥程度適合的樣品3的溶解效率較好，但不能將干燥過度的發(fā)酵豆粕樣品1、2中的可溶性蛋白提取出來，所以根據(jù)SDS-PAGE電泳圖并不能說明抗原蛋白條帶少和淺的樣品中實(shí)際抗原蛋白量就少。

圖1 不同樣品常規(guī)處理后SDS-PAGE電泳

2.2 抗原蛋白定量測定試劑盒（ELISA法）測抗原蛋白

按試劑盒說明書對4種豆粕樣品進(jìn)行抗原蛋白含量的檢測。其樣品處理液主要為Tris-HCl、β-巰基乙醇等，所得結(jié)果如表1所示。

表1 ELISA法定量檢測樣品中的抗原蛋白

由表1可知，使用試劑盒中的樣品提取液提取，樣品1中的抗原蛋白仍很低，而樣品2和樣品3分別是其4倍和27倍左右。由于樣品提取液的提取效率因素，ELISA法定量測定的只是溶解到提取液中抗原蛋白的量，由于發(fā)酵豆粕表層蛋白變性和發(fā)生美拉德反應(yīng)使抗原蛋白不能很好地釋放出來，所以ELISA法也不能檢測樣品中抗原蛋白的實(shí)際含量。

2.3 樣品氫氧化鉀溶液處理后SDS-PAGE電泳

試驗(yàn)用0.2%、0.4%、0.6%氫氧化鉀溶液分別處理各發(fā)酵豆粕樣品，同時用Bradford法[6]測定可溶性蛋白含量。確定能溶解可溶性蛋白量大致相近的合適氫氧化鉀溶液濃度。最終確定0.6%氫氧化鉀溶液處理樣品60 min所獲得的可溶性蛋白的量大致相當(dāng)，如表2。

表2 Bradford法測定發(fā)酵豆粕樣品中可溶性蛋白含量

將0.6%氫氧化鉀溶液處理樣品上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，所得電泳圖見圖2。

圖2 不同樣品0.6%氫氧化鉀處理后SDS-PAGE電泳

從圖2可以看出，樣品1、2經(jīng)0.6%氫氧化鉀溶液處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，出現(xiàn)明顯的抗原蛋白條帶，且比樣品3的抗原蛋白條帶更深，說明0.6%氫氧化鉀溶液可將樣品1、2中被蛋白質(zhì)變性表層包裹的抗原蛋白提取出來，同時說明樣品1、2比樣品3干燥程度高。

根據(jù)圖2，使用Gelanalyzer軟件對電泳圖進(jìn)行蛋白條帶分析，選擇并計算整個泳道的全部區(qū)域和抗原蛋白各亞基的光密度值（圖3），計算出抗原蛋白各亞基所占總可溶性蛋白的百分比及得出抗原蛋白降解程度，如表3。

由表3可知，樣品1、2、3與未發(fā)酵豆粕相比，各抗原蛋白亞基百分含量都有明顯降低，而樣品3比樣品1、2降低的幅度大，說明樣品3中抗原蛋白的降解程度高于樣品1、2。這也正如SDS-PAGE電泳圖所示，樣品3的雜帶較多，分解的蛋白使整個泳道表觀更為彌散。也由此說明樣品Tris-HCl處理后SDS-PAGE電泳圖的表觀結(jié)果及ELISA法定量測定的抗原蛋白值與實(shí)際不符。

圖3 根據(jù)光強(qiáng)度選擇抗原蛋白條帶

表3 抗原蛋白各亞基所占總可溶性蛋白的百分比

3 討論

SDS-PAGE和ELISA法是當(dāng)前測定發(fā)酵豆粕中抗原蛋白簡單易行的方法。而SDS-PAGE主要是用常規(guī)提取液Tris-HCl提取樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳以觀察豆粕抗原蛋白的降解情況。因發(fā)酵豆粕在干燥工序的烘干溫度不相同，溫度過高會發(fā)生蛋白質(zhì)變性和美拉德反應(yīng)，所以造成用Tris-HCl提取可溶性蛋白效率上存在很大差異，因而使用以上提取方法不能真正說明發(fā)酵豆粕中抗原蛋白的水平。試驗(yàn)也嘗試使用高濃度的Tris-HCl提取可溶性蛋白，但對干燥程度高的發(fā)酵豆粕的提取量依然較低。使用ELISA法檢測抗原蛋白，由于提取液（主要成分為Tris-HCl、β-巰基乙醇）也不能破壞豆粕變性的蛋白質(zhì)表面，抗原蛋白不能有效釋放，獲得的數(shù)值僅為溶解到提取液中的抗原蛋白。如用一定濃度的KOH提取抗原蛋白然后用ELISA法檢測其含量，因KOH會使蛋白質(zhì)變性，抗體不能與抗原反應(yīng)，因此也不能獲得有效數(shù)值。

綜合以上試驗(yàn)方法的缺點(diǎn)，通過試驗(yàn)確定用0.6%的氫氧化鉀破壞發(fā)酵豆粕變性表面，并提取出足夠量的可溶性蛋白，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，使用Gelanalyzer軟件對電泳圖進(jìn)行分析，通過計算抗原蛋白所占可溶性蛋白的比例，分析樣品中的抗原蛋白的降解情況，因此獲得的結(jié)果比較客觀、準(zhǔn)確。

本法因提取可溶性蛋白的效率較高，比用Tris-HCl提取更能真實(shí)說明發(fā)酵豆粕抗原蛋白水平。結(jié)合Gelanalyzer軟件分析，獲得可溶性蛋白中抗原蛋白的比例，從而較為客觀說明發(fā)酵豆粕抗原蛋白的降解情況。使用方法可同時結(jié)合檢測氫氧化鉀蛋白質(zhì)溶解度[5]及肽的含量[7]，了解發(fā)酵豆粕是否過熟及抗原蛋白的降解程度，以佐證發(fā)酵豆粕產(chǎn)品的品質(zhì)。