喂食甘草甜素對(duì)點(diǎn)帶石斑魚(yú)非特異性免疫力的影響

■崔 培 陳成勛 王慶奎 邢克智 趙海運(yùn)

(天津市水產(chǎn)生態(tài)與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)系，天津 300384)

點(diǎn)帶石斑魚(yú)(Epinephelus malabaricus)隸屬于鱸形目、鮨科、石斑魚(yú)亞科、石斑魚(yú)屬，其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，享有上等佳肴之美譽(yù)，是東南亞沿海重要的高檔海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一。近年來(lái)，點(diǎn)帶石斑魚(yú)高密度養(yǎng)殖在我國(guó)福建、廣東、廣西和海南沿海地區(qū)發(fā)展迅速。但隨著集約化、設(shè)施化高密度養(yǎng)殖模式的擴(kuò)大，加上配合飼料質(zhì)量不均衡，導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境惡化，自身健康狀況下降等一系列問(wèn)題的出現(xiàn)，在養(yǎng)殖過(guò)程中爆發(fā)大規(guī)模的疾病[1-3]，給養(yǎng)殖戶(hù)帶來(lái)相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失。因此迫切需要尋找能夠提高點(diǎn)帶石斑魚(yú)非特異性免疫力和抗病力的免疫增強(qiáng)劑。

甘草(Glycyrrhiza uralensis Fiseh)，又名甜草根、甜甘草、甜根子、粉草等，為豆科(Legum inosae)甘草屬(Glycyrrhiza)多年生宿根草本植物，在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中被稱(chēng)為“百草之王”。其性平味甘，在臨床上具有抗病毒、抗細(xì)菌、抗氧化、抗衰老、增效解毒，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力等作用[4-5]。已有研究發(fā)現(xiàn)，甘草可提高肉雞的進(jìn)食欲望，降低能耗，還可促進(jìn)山羊T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，從而增強(qiáng)其細(xì)胞免疫功能[6]。王文博等[7]也發(fā)現(xiàn)甘草粗提物對(duì)鯽免疫功能有良好的調(diào)節(jié)作用。但有關(guān)甘草甜素對(duì)點(diǎn)帶石斑魚(yú)免疫功能的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，因此，本試驗(yàn)在飼料中添加不同水平的甘草甜素，研究其對(duì)點(diǎn)帶石斑魚(yú)非特異性免疫的影響，為石斑魚(yú)工廠化健康養(yǎng)殖以及為甘草甜素在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用提供一些參考。

1 試驗(yàn)材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用點(diǎn)帶石斑魚(yú)[(84.11±0.50)g]由天津市海發(fā)珍品實(shí)業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和日常管理

基礎(chǔ)飼料中分別添加0、50、200、350、500 mg/kg甘草甜素，制成5種試驗(yàn)飼料。基礎(chǔ)飼料配方見(jiàn)表1，復(fù)合維生素和復(fù)合礦物質(zhì)按暖水性魚(yú)類(lèi)的營(yíng)養(yǎng)需求添加[8]。試驗(yàn)分為5組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)飼喂2箱，共30箱，每箱30尾。每7 d取樣1次，每次取3箱，每箱15尾，測(cè)定血液中的非特異性免疫指標(biāo)。

表1 基礎(chǔ)飼料原料組成（%）

試驗(yàn)用水經(jīng)生物包處理、充純氧，并經(jīng)紫外線消毒后使用，采用循環(huán)流水，24 h充氣。飼養(yǎng)期間，水溫保持在26～28 ℃，鹽度28～30，溶解氧5.6～6.5 mg/l，NH4+-N 1.00～1.50 mg/l，NO2--N 0.15～0.40 mg/l。每天換水3次，換水時(shí)清除糞便。每天喂食2次（早8:30，晚4:00），每次飽食投喂。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及測(cè)定方法

試驗(yàn)魚(yú)用MS-222麻醉后，尾柄采血，離心(5 000 r/min、10 min、4 ℃)，-80 ℃保存，測(cè)定血清溶菌酶(LZM)活力、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)活力，總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)含量，補(bǔ)體C3和C4含量。另一部分用5%肝素鈉抗凝，計(jì)數(shù)血液中的白細(xì)胞數(shù)。

ACP、AKP、TP和ALB用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，補(bǔ)體C3和C4用浙江伊利康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。白蛋白/球蛋白（A/G）=A/(TP-A)[9]。

1.3.1 溶菌酶（LZM）活力的測(cè)定

將活化后的溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)用 PBS(pH 值 6.4)將濃度調(diào)至 OD570≈0.3，取150 μl菌懸液均勻涂布在固體培養(yǎng)基上。在培養(yǎng)基上等間距放置直徑4.32 mm的滅菌濾紙片，向?yàn)V紙片中心滴加濃度分別為375、750、1 125、1 500、1 875、2 250 U/ml的溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μl，28℃于培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h后測(cè)量抑菌圈直徑。以抑菌圈直徑為橫坐標(biāo)(X)，溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(Y)得到回歸方程。取10 μl血清加在濾紙片上，按上述方法孵育，測(cè)量抑菌圈直徑。將抑菌圈直徑代入回歸方程，計(jì)算出血清中溶菌酶活力。

1.3.2 血液白細(xì)胞計(jì)數(shù)

血液用白細(xì)胞稀釋液稀釋100倍。白細(xì)胞稀釋液配制如下：98 ml蒸餾水加入1%亞甲藍(lán)3滴，冰醋酸2 ml，配制成100 ml白細(xì)胞稀釋液。血液白細(xì)胞數(shù)（個(gè)/l）=5個(gè)大方格中白細(xì)胞數(shù)×50 000×1 000×稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)用EXCEL軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示。采用SPSS13.0進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，單因素方差分析檢驗(yàn)試驗(yàn)組間顯著性，若組間差異顯著(P＜0.05)，則作Duncan’s法多重比較分析。

2 結(jié)果

2.1 溶菌酶（LZM）的活力（見(jiàn)表2）

表2 點(diǎn)帶石斑魚(yú)血清LZM活力（U/g prot.）

由表2可知，第7 d時(shí)，各試驗(yàn)組的LZM活力均高于0 mg/kg組，其中，350 mg/kg組和500 mg/kg組顯著高于0 mg/kg組，14 d時(shí)50 mg/kg組顯著高于0 mg/kg組，而第21、28 d各試驗(yàn)組與0 mg/kg組間均無(wú)顯著差異。

2.2 血清酸性磷酸酶（ACP）活力

表3 點(diǎn)帶石斑魚(yú)血清ACP活力（U/100 ml）

甘草甜素對(duì)點(diǎn)帶石斑魚(yú)血清ACP的影響見(jiàn)表3。在第7 d時(shí)，除50 mg/kg組外，其他各組均顯著高于0 mg/kg組；第14 d時(shí)，350 mg/kg組和500 mg/kg組顯著低于0 mg/kg組。

2.3 血清堿性磷酸酶（AKP）活力

甘草甜素對(duì)點(diǎn)帶石斑魚(yú)血清AKP的影響見(jiàn)表4。在第7、21 d以及28 d時(shí)，各試驗(yàn)組AKP活力與0 mg/kg組相比，均無(wú)顯著差異；第14 d時(shí)，各試驗(yàn)組AKP活力均低于0 mg/kg組，其中，500 mg/kg組顯著低于0 mg/kg組。

表4 點(diǎn)帶石斑魚(yú)血清AKP活力（U/100 ml）

2.4 補(bǔ)體C3和C4的活力

甘草甜素對(duì)點(diǎn)帶石斑魚(yú)血清補(bǔ)體C3的影響見(jiàn)表5。第7 d時(shí)，各試驗(yàn)組的補(bǔ)體C3含量均高于0 mg/kg組，其中，500 mg/kg組顯著高于0 mg/kg組，第14、21、28 d時(shí)，各試驗(yàn)組補(bǔ)體C3含量均與0 mg/kg組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表5 點(diǎn)帶石斑魚(yú)血清補(bǔ)體C3含量（g/l）

甘草甜素對(duì)點(diǎn)帶石斑魚(yú)血清補(bǔ)體C4的影響見(jiàn)表6。第7 d時(shí)，各試驗(yàn)組補(bǔ)體C4活性均高于0 mg/kg組，且350 mg/kg組顯著高于0 mg/kg組；第14 d時(shí)，350 mg/kg組和500 mg/kg組顯著低于0 mg/kg組；第21 d和28 d，各試驗(yàn)組與0 mg/kg組相比均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表6 點(diǎn)帶石斑魚(yú)血清補(bǔ)體C4含量（g/l）

2.5 白蛋白/球白蛋比值

甘草甜素對(duì)點(diǎn)帶石斑魚(yú)血清A/G比值見(jiàn)表7。第7 d時(shí)，各試驗(yàn)組的A/G比值均顯著低于0 mg/kg組(P＜0.05)；第14、21 d時(shí)，各試驗(yàn)組的白蛋白/球蛋白比值與0 mg/kg組相比均無(wú)顯著差異(P＞0.05)；第28 d時(shí)，200 mg/kg組顯著高于0 mg/kg組(P＜0.05)。

2.6 白細(xì)胞數(shù)目

甘草甜素對(duì)點(diǎn)帶石斑魚(yú)血液中白細(xì)胞數(shù)目的影響見(jiàn)表8。第7 d時(shí)50 mg/kg組和350 mg/kg組白細(xì)胞數(shù)目均顯著高于0 mg/kg組（P＜0.05）；第14、21、28 d時(shí)，各試驗(yàn)組白細(xì)胞數(shù)目與0 mg/kg組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表7 點(diǎn)帶石斑魚(yú)血清白蛋白/球蛋白(A/G)比值（mg/ml）

表8 點(diǎn)帶石斑魚(yú)血液白細(xì)胞數(shù)目（×1011個(gè)/l）

3 討論與小結(jié)

LZM是一種體液免疫指標(biāo)，它是機(jī)體受到外界刺激的一項(xiàng)基本防御機(jī)制，廣泛存在于生物體液、血清和巨噬細(xì)胞中，在動(dòng)物免疫防御中發(fā)揮重要作用，其活性高低是決定吞噬細(xì)胞能否殺滅所吞噬致病菌的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[10-13]。陳超然等[14]對(duì)中華鱉的研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加15、25、35、45、55 mg/kg的甘草素對(duì)其血清LZM活性沒(méi)有顯著影響。楊興斌等[15]用3種不同分子量大小的當(dāng)歸多糖體外培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞48 h后發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸多糖能顯著提高巨噬細(xì)胞LZM活力。王慶奎等[16]對(duì)點(diǎn)帶石斑魚(yú)的研究發(fā)現(xiàn)，喂食當(dāng)歸多糖350、500 mg/kg組7 d后能顯著提高點(diǎn)帶石斑魚(yú)血漿LZM活力，而14～28 d內(nèi)LZM活力與0 mg/kg組無(wú)顯著差異。本試驗(yàn)中，第7 d時(shí)，各試驗(yàn)組的LZM活力均高于0 mg/kg組，其中，350 mg/kg組和500 mg/kg組顯著高于0 mg/kg組，第14 d時(shí)，50 mg/kg組顯著高于0 mg/kg組，其他各組以及第21 d、28 d各試驗(yàn)組與0 mg/kg組相比均無(wú)顯著差異。說(shuō)明投喂高劑量(350、500 mg/kg組)的甘草甜素能在短時(shí)間(7 d)內(nèi)提高點(diǎn)帶石斑魚(yú)血清LZM活力，投喂50 mg/kg的甘草甜素14 d也可顯著提高LZM活力，但隨著喂食時(shí)間的延長(zhǎng)LZM活力恢復(fù)至0 mg/kg組水平。

酸性磷酸酶（ACP）是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，與機(jī)體物質(zhì)代謝關(guān)系密切，它通過(guò)催化磷蛋白中磷酯鍵的水解，直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝，在體內(nèi)細(xì)胞調(diào)節(jié)過(guò)程中起重要作用。周進(jìn)等[17]發(fā)現(xiàn)，投喂含A3α肽聚糖的飼料40 d后，可以顯著提高牙鲆（Paralichthys olivaceus）肝臟中ACP活力。牟海津等[18]對(duì)櫛孔扇貝的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)蟲(chóng)草多糖和海藻多糖注射刺激后，櫛孔扇貝血清中ACP活性增強(qiáng)。吳桂玲[19]在飼料中添加100 mg/kg和500 mg/kg A3α肽聚糖喂食花鱸(Lateolabrax japonicus)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，42 d后花鱸肝臟ACP活力與0 mg/kg組無(wú)顯著差異，而喂食84 d后兩組的ACP活力均顯著低于0 mg/kg組，并認(rèn)為這是由于出現(xiàn)免疫疲勞所致。本試驗(yàn)中，投喂第7 d時(shí)，除50 mg/kg組外，其他各組均顯著高于0 mg/kg組。

堿性磷酸酶(AKP)廣泛存在于微生物和動(dòng)物界，能催化所有的磷酸單脂的水解反應(yīng)及磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，AKP活性與動(dòng)物的生長(zhǎng)呈正相關(guān)，在一定程度上反映動(dòng)物的生長(zhǎng)速度[20]?？潞频萚21]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，投喂中草藥2號(hào)的鮑中AKP酶活力極顯著高于對(duì)照。本試驗(yàn)中，在第7、21 d以及28 d時(shí)，各試驗(yàn)組AKP活力與0 mg/kg組相比，均無(wú)顯著差異，第14 d時(shí)，各試驗(yàn)組AKP活力均低于0 mg/kg組，其中，500 mg/kg組顯著低于0 mg/kg組。

硬骨魚(yú)類(lèi)的補(bǔ)體系統(tǒng)在防御細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲(chóng)侵襲過(guò)程中具有重要作用，也可介導(dǎo)免疫病理的損傷性反應(yīng)，是機(jī)體內(nèi)具有重要生物學(xué)意義的效應(yīng)系統(tǒng)和效應(yīng)放大系統(tǒng)[22]。補(bǔ)體C3是補(bǔ)體系統(tǒng)中含量最多、最重要的一個(gè)組分，它是補(bǔ)體兩條主要激活途徑的中心環(huán)節(jié)，被激活后裂解為C3a和C3b。C3a參與具有C3a受體的白細(xì)胞結(jié)合，在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。補(bǔ)體C4是補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑的一個(gè)重要組分，是補(bǔ)體活化的經(jīng)典途徑和MBL途徑的必要成分，裂解產(chǎn)物C4b參與C3的裂解及后續(xù)的補(bǔ)體反應(yīng)[23]。研究發(fā)現(xiàn)：在飼料中添加適量免疫多糖（酵母細(xì)胞壁）可以增強(qiáng)中華鱉中補(bǔ)體C3和C4的活性，但添加過(guò)量后則會(huì)抑制補(bǔ)體C3和C4活性。本試驗(yàn)中，投喂甘草甜素7 d可提高補(bǔ)體C3和C4含量，且500 mg/kg組的補(bǔ)體C3含量顯著高于0 mg/kg組，350 mg/kg組的補(bǔ)體C4含量顯著高于0 mg/kg組。

A/G值是反映魚(yú)類(lèi)非特異性免疫力的重要指標(biāo)，A/G值越低說(shuō)明免疫球蛋白含量越高，免疫力越高[9]。本研究發(fā)現(xiàn)喂食甘草甜素7 d能顯著降低A/G值。

在魚(yú)類(lèi)血細(xì)胞中,吞噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞都具有吞噬異物的能力，是魚(yú)類(lèi)非特異性免疫的主要指標(biāo)之一，它們的數(shù)量和吞噬能力的高低可直接反映出魚(yú)類(lèi)非特異性免疫能力的大小，在魚(yú)類(lèi)的非特異性免疫中起著至關(guān)重要的作用。本試驗(yàn)中，第7 d時(shí)添加甘草甜素50、350 mg/kg組白細(xì)胞數(shù)目明顯增多。

投喂350 mg/kg組和500 mg/kg組的甘草甜素7 d可以顯著提高點(diǎn)帶石斑魚(yú)血清LZM、ACP活力，顯著降低A/G值，投喂500 mg/kg組的甘草甜素7 d可以顯著提高血清補(bǔ)體C3含量，投喂350 mg/kg組的甘草甜素7 d可以顯著提高血清補(bǔ)體C4含量，增加白細(xì)胞數(shù)目。因此，建議飼料中添加量為350 mg/kg，連續(xù)喂食7 d。