新生仔豬急性腹瀉疫情中5種病毒感染的分子檢測(cè)

■常洪濤 杜季梅 陳 陸 趙 軍 郭占達(dá) 王川慶

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州，450002）

豬腹瀉性疫病是指以感染豬只發(fā)生嘔吐、腹瀉、快速脫水及高死亡率為主要特征的一類疾病，其病因極其復(fù)雜，即許多因素如管理、飼料、豬生理特性和病原微生物感染等均可引起，但以豬流行性腹瀉（PED）、豬傳染性胃腸炎（TGE）、豬輪狀病毒（GAR）、豬偽狂犬?。≒R）和豬瘟（SCF）5種病毒性疫病最為普遍和嚴(yán)重[1-3]。2010年11月至今，新生仔豬急性腹瀉疫情在全國(guó)范圍內(nèi)大爆發(fā)，主要感染1周齡以內(nèi)（尤其是2～3 d）的初生仔豬，發(fā)病率高達(dá)90%以上，死亡率幾乎為100%，同時(shí)具有發(fā)病急、傳播速度極快、反復(fù)發(fā)作及藥物完全無(wú)效等特征。種豬、保育豬和育肥豬多呈一過(guò)性感染，一般一周內(nèi)可自行康復(fù)，但產(chǎn)房母豬感染后會(huì)造成泌乳量減少，乳汁稀薄，品質(zhì)下降。河南省是養(yǎng)豬大省，年出欄量多年穩(wěn)居全國(guó)前列，也是此次疫情發(fā)生和流行最為嚴(yán)重的省份之一，經(jīng)濟(jì)損失慘重。為查明河南省新生仔豬急性腹瀉疫情的主要病因，本研究分別應(yīng)用RT-PCR和PCR方法對(duì)上述5種豬主要腹瀉性疫病的病原感染進(jìn)行了分子檢測(cè)，從而為其有效診斷和綜合防治提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

待檢樣品為2012年河南省豫東地區(qū)、豫南地區(qū)、豫西地區(qū)和豫北地區(qū)98個(gè)豬場(chǎng)送檢的發(fā)病仔豬的腸道、淋巴結(jié)、脾臟、三叉神經(jīng)和腦等疑似病料，凍存待用。

1.2 參考毒株

豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬輪狀病毒（GARV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）等參考毒株由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 主要試劑和儀器

DNA提取試劑盒由北京百泰克公司提供；RNA提取用TRIZOL LS Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；TaqD?NA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、DL2000 Marker等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；組織搗碎儀、生物安全柜、PCR擴(kuò)增儀和高速冷凍離心機(jī)為Thermo公司產(chǎn)品；倒置生物顯微鏡為olympus公司產(chǎn)品；Alpha Innotech凝膠成像儀為美國(guó)Alpha公司產(chǎn)品，DYC3113型電泳槽為北京六一儀器廠產(chǎn)品。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank收錄的PEDV ORF3基因序列、TGEV N基因序列、GARV VP6基因序列、CSFV E2基因序列、PRV gE基因序列應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)5對(duì)引物，各引物序列詳見(jiàn)表1。引物合成由上海生工生物工程公司完成。

表1 用于檢測(cè)5種病毒性疫病的PCR引物

1.5 病料處理和DNA、RNA提取

用PBS緩沖液將各病料5倍稀釋，在無(wú)菌操作臺(tái)上去除筋腱等結(jié)締組織，使用小型組織搗碎儀將其制成勻漿，反復(fù)凍融3次，以4℃、8 000 r/min離心5 min取上清液，按TRIZOL操作步驟和DNA提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，分別提取病料總RNA和DNA。并應(yīng)用所設(shè)計(jì)的PEDV、TGEV、GARV和CSFV下游引物對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，其cD?NA和PRV的DNA于-20℃保存待用。

1.6 PCR檢測(cè)

PEDV、TGEV、GARV、CSFV和PRV的PCR反應(yīng)各體系及反應(yīng)參數(shù)詳見(jiàn)表2、表3。

表2 PEDV、TGEV、GARV、CSFV和PRV的PCR各反應(yīng)體系

表3 PEDV、TGEV、GARV、CSFV、PRV的 PCR各循環(huán)參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品檢測(cè)結(jié)果

利用所設(shè)計(jì)的PEDV、TGEV、GARV、CSFV和PRV引物，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)和PCR技術(shù)分別擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為964、528、1 194、276、808 bp的基因片段，得到與預(yù)期目的片段大小一致的擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)圖1～圖5。

圖2 部分樣品TGEVV檢測(cè)結(jié)果

圖3 部分樣品TGEV檢測(cè)結(jié)果

圖4 部分樣品CSFV檢測(cè)結(jié)果

圖5 部分樣品PRV檢測(cè)結(jié)果

2.2 河南省豬場(chǎng)腹瀉病原分子檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表4）

由表4可知，送檢的181份被檢樣品中，PEDV陽(yáng)性樣品數(shù)為129份，陽(yáng)性檢出率高達(dá)71.27%，與TGEV、GARV、CSFV和PRV的混合感染陽(yáng)性樣品數(shù)分別為5份、4份、103份和31份，陽(yáng)性檢出率分別為2.76%、2.21%、56.91%和17.13%，與TGEV和GARV的三重混合感染陽(yáng)性樣品數(shù)為1份，陽(yáng)性檢出率僅為0.55%，而與CSFV和PRV的三重混合感染陽(yáng)性樣品數(shù)為31份，陽(yáng)性檢出率為17.10%；TGEV、GARV、CSFV和PRV的陽(yáng)性樣品數(shù)分別為10份、4份、125份和80份，陽(yáng)性檢出率分別為5.52%、2.21%、69.06%和44.20%；CSFV和PRV的混合感染陽(yáng)性樣品數(shù)為58份，陽(yáng)性檢出率為32.04%。

2.3 腹瀉病原檢測(cè)陽(yáng)性豬場(chǎng)在不同地區(qū)、不同季節(jié)和不同規(guī)模豬場(chǎng)的分布結(jié)果（見(jiàn)表5）

由表5可知，98個(gè)發(fā)病送檢豬場(chǎng)中均檢測(cè)出豬腹瀉性疫病病原呈陽(yáng)性，其中豫東、豫南和豫北地區(qū)等養(yǎng)豬較為密集地區(qū)的陽(yáng)性場(chǎng)數(shù)分別為28個(gè)、31個(gè)和32個(gè)，所占比例分別為28.57%、31.63%和32.65%，分布較為均勻；在季節(jié)分布上，以冬季所占比例最多，為42.86%，其次為秋季和春季，分別為24.49%和17.35%，夏季最低，為15.31%；規(guī)?；i場(chǎng)為64個(gè)，占65.31%，中小型豬場(chǎng)為34個(gè)，占34.69%。

表4 河南省豬場(chǎng)腹瀉性病原分子檢測(cè)結(jié)果

表5 檢測(cè)陽(yáng)性豬場(chǎng)在不同地區(qū)、不同季節(jié)和不同規(guī)模的分布結(jié)果

3 討論

自2010年冬季至今，新生仔豬急性腹瀉在全國(guó)范圍內(nèi)廣泛流行，已成為豬場(chǎng)常發(fā)傳染病之一，是當(dāng)前造成新生仔豬高死亡率的最主要原因，且疫情有逐步擴(kuò)大和日趨加重之勢(shì)，控制效果極不理想。其根本原因在于引起豬腹瀉表現(xiàn)的病原體在流行病學(xué)、臨床癥狀、剖檢變化上非常相似，且多為并發(fā)感染或者混合感染，給臨床診斷帶來(lái)極大困難，也無(wú)法采取針對(duì)性的有效措施。因此，開(kāi)展對(duì)新生仔豬急性腹瀉疫情中主要病原感染的分子檢測(cè)，探明引起此次疫情的真正病因，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究對(duì)河南省98家豬場(chǎng)送檢的具有腹瀉表現(xiàn)的仔豬病料較為全面系統(tǒng)地進(jìn)行了PEDV、TGEV、GARV、CSFV和PRV的分子檢測(cè)，結(jié)果顯示，PEDV陽(yáng)性檢出率高達(dá)71.27%，是引起此次疫情的最主要病因。值得注意的是，這些豬場(chǎng)多數(shù)都曾接種過(guò)TGE-PED二聯(lián)滅活疫苗，但并未使免疫豬群獲得有效保護(hù)，我們分析一方面是由于當(dāng)前PEDV流行毒株S基因（PEDV主要免疫原性基因）比疫苗毒株CV777在S1區(qū)部分部位分別插入15個(gè)堿基和缺失6個(gè)堿基，已發(fā)生較大變異；二是由于PEDV免疫是以局部黏膜免疫為主，一般認(rèn)為只有弱毒活苗才能在乳腺等局部產(chǎn)生可有效抵抗PEDV感染的sI?gA，但我國(guó)目前并未批準(zhǔn)活苗推廣使用[4-6]，而經(jīng)肌肉注射或后海穴注射的滅活疫苗其抗體類型主要是IgG[7]，并不能產(chǎn)生確切的免疫效果。因此，研發(fā)針對(duì)PEDV流行毒株的新型疫苗迫在眉睫。而TGEV的檢測(cè)陽(yáng)性率為5.52%，與PEDV的混合感染率也僅為2.76%，這和PEDV多與TGEV混合感染的傳統(tǒng)理論并不相符，主要原因在于目前TGEV流行毒株并未發(fā)生較大變異，現(xiàn)有疫苗可對(duì)其產(chǎn)生有效保護(hù)有關(guān)。

我國(guó)擁有世界上最優(yōu)秀的豬瘟兔化弱毒疫苗[8]，豬偽狂犬基因缺失疫苗配合鑒別診斷試劑盒的方案經(jīng)多年推廣使用也已使該病逐步趨于凈化[9-10]，但本研究中CSFV和PRV的陽(yáng)性檢出率分別高達(dá)69.06%和44.20%，PEDV與CSFV、PRV的三重混合感染的陽(yáng)性檢出率為17.10%，CSFV和PRV的混合感染陽(yáng)性檢出率為32.04%，從而說(shuō)明在此次腹瀉疫情中二者扮演著推波助瀾的重要角色，同時(shí)也使部分豬場(chǎng)腹瀉疫情反復(fù)發(fā)生的現(xiàn)象得以合理解釋。究其原因是，兩年來(lái)多數(shù)豬場(chǎng)在發(fā)生新生仔豬急性腹瀉疫情時(shí)，均通過(guò)大面積使用發(fā)病仔豬的腸內(nèi)容物和糞便來(lái)進(jìn)行“強(qiáng)毒返飼”，使感染母豬產(chǎn)生高水平母源抗體以通過(guò)天然被動(dòng)免疫的方式來(lái)保護(hù)初生仔豬，短期內(nèi)取得了一定效果。但隨之而來(lái)的問(wèn)題是，若返飼病料中污染有CSFV和PRV強(qiáng)毒，必將造成母豬大面積感染，并垂直傳播給胎兒，使其消化道和免疫器官功能不健全，當(dāng)各類消化系統(tǒng)致病因子（尤其是PEDV）侵入消化道時(shí)，便會(huì)出現(xiàn)共同癥狀為腹瀉，使疫情更為嚴(yán)重和復(fù)雜化，因此本研究結(jié)果提示豬場(chǎng)在進(jìn)行返飼時(shí)應(yīng)充分考慮病料中CSFV和PRV等強(qiáng)毒所帶來(lái)的嚴(yán)重污染問(wèn)題。

98個(gè)發(fā)病送檢豬場(chǎng)中均檢測(cè)出豬腹瀉性疫病病原呈陽(yáng)性，豫東、豫南和豫北地區(qū)等養(yǎng)豬較為密集地區(qū)的陽(yáng)性場(chǎng)所占比例均勻，表明新生仔豬急性腹瀉疫情在河南全省已廣泛發(fā)生和流行，改變了“PED和TGE等腹瀉性疫病多呈地方性流行”的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)。在季節(jié)分布上，以秋、冬季節(jié)陽(yáng)性豬場(chǎng)占比例較多，但春、夏季節(jié)已呈逐步上升趨勢(shì)，尤其是夏季也有15.31%的豬場(chǎng)發(fā)病，從而提示其季節(jié)性已不明顯。管理水平較高、免疫和保健工作較為到位的規(guī)模化豬場(chǎng)的陽(yáng)性場(chǎng)數(shù)遠(yuǎn)高于中小型豬場(chǎng)，其原因仍有待于進(jìn)一步深入分析。本研究結(jié)果說(shuō)明應(yīng)把新生仔豬急性腹瀉疫情納入規(guī)?；i場(chǎng)和中小型豬場(chǎng)全年高度警惕和重點(diǎn)防控的重大疫病。