殼聚糖對肉牛血液生化指標(biāo)及后腸道菌群的影響

■于 萍 閆素梅 史彬林 趙育國 徐元慶 郭祎瑋 田麗新

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.呼倫貝爾市畜牧研究所，內(nèi)蒙古海拉爾 021008)

殼聚糖是甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，是一種天然的堿性多糖，也是自然界僅次于纖維素的第二大類高分子天然化合物，在化工、紡織、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用。近些年來，人們開始對殼聚糖作為一種飼料添加劑在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用效果進(jìn)行了研究。有試驗(yàn)表明，在動物日糧中添加殼聚糖，可以改善生長性能，調(diào)節(jié)脂肪代謝，緩解免疫應(yīng)激，改善腸道微生態(tài)環(huán)境,因此，殼聚糖作為一種潛在的天然來源的抗生素促生長劑替代品，極具研發(fā)價值。劉靜娜等（2010）對高脂血癥大鼠的試驗(yàn)表明，殼聚糖能降低大鼠的血脂濃度及肝臟脂肪沉積，對高脂血癥有預(yù)防作用。在高脂飼料中添加5%殼聚糖后，血清中TG、TC、LDL-C濃度顯著降低，HDL-C濃度顯著升高。此外，李慧英等(2009)研究表明，適宜劑量的殼聚糖可降低肉仔雞血清ACTH和皮質(zhì)酮，緩解肉仔雞的免疫應(yīng)激。關(guān)于殼聚糖對動物血清甲狀腺素、生長激素及鈣磷等影響的研究報道較少見?？氯~艷等(2000)在鵪鶉上的試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加3%的殼聚糖可顯著提高三碘甲腺原氨酸（T3）水平。Zhang等（2008）研究表明，日糧殼聚糖可提高仔豬血清中IGF-1和GH的濃度。任海軍（2008）研究表明，日糧添加0.1%殼聚糖可明顯降低奶牛血鈣水平，升高血磷，而對尿素氮無顯著影響。呂丹娜（2006）發(fā)現(xiàn)，殼聚糖對肉仔雞盲腸大腸桿菌的增殖有顯著的抑制作用，而對盲腸乳酸桿菌和雙歧桿菌的增殖有不同程度的促進(jìn)作用。但迄今為止，關(guān)于殼聚糖在肉牛上的相關(guān)研究鮮見報道。本試驗(yàn)以肉牛為試驗(yàn)動物，探討日糧殼聚糖對其血液生化指標(biāo)和后腸道菌群的影響，為殼聚糖在肉牛生產(chǎn)中的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用殼聚糖由山東濟(jì)南海德貝海洋生物工程有限公司提供，脫乙酰度為85.09%,黏度為45 cps。

1.2 試驗(yàn)動物與試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)選擇體重、月齡接近，健康無病的24頭西門塔爾育肥公牛隨機(jī)分為3個日糧處理組，每組8頭牛。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，其他兩組分別是在基礎(chǔ)日糧中添加500 mg/kg和1 000 mg/kg殼聚糖。試驗(yàn)前對每組牛進(jìn)行編號、稱重。預(yù)試期為7 d、正試期84 d,分前、中、后3期進(jìn)行，每期28 d。

1.3 試驗(yàn)日糧及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)期間試驗(yàn)牛自由采食，自由飲水，各組?；A(chǔ)日糧組成和飼養(yǎng)管理保持一致。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 血液生化指標(biāo)

在飼養(yǎng)試驗(yàn)前、中、后期每期最后1 d進(jìn)行尾靜脈采血30 ml，4 000 r/min離心10 min，分離血清，用于測定血液相關(guān)指標(biāo)。

1.4.1.1 脂代謝相關(guān)指標(biāo)

甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）采用酶比色法，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）采用選擇性沉淀法測定，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，測定儀器為國產(chǎn)723型可見光分光光度計。

1.4.1.2 內(nèi)分泌指標(biāo)

促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、皮質(zhì)醇（CORT）、三碘甲腺原氨酸（T3）、四碘甲腺原氨酸（T4）、生長激素（GH）及類胰島素生長因子（IGF-1）采用放射免疫分析法測定，試劑盒由北京華英生物技術(shù)研究所提供，具體操作過程按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.1.3 其它生化指標(biāo)

血清鈣含量采用甲基百里香酚法，磷采用孔雀綠直接顯色法，尿素氮采用二乙酰-比色法測定。試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.4.2 后腸道微生物

1.4.2.1 樣品采集與測定指標(biāo)

分別于試驗(yàn)開始后第42、70 d從試驗(yàn)牛直腸內(nèi)距肛門約20～30 cm處采集新鮮糞樣10 g左右，分裝于滅菌的離心管內(nèi)-80℃凍存，用于測定糞樣中大腸桿菌、乳酸菌和總需氧菌數(shù)量。

1.4.2.2 測定方法

將凍存的糞樣于室溫自然解凍后無菌稱取1 g，加入盛有9 ml高壓滅菌后生理鹽水的試管中，經(jīng)充分震蕩，制成1∶10的均勻稀釋液。再移取1∶10稀釋液1 ml，注入含有9 ml無菌生理鹽水的試管內(nèi)充分混勻制成1∶100的稀釋液，按上述操作連續(xù)逐級稀釋10倍，直到10-8稀釋度。選擇3個適宜于計數(shù)的稀釋度，接種于平板培養(yǎng)基或含有溶化厭氧菌培養(yǎng)基的Hungates滾管中。于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h后，計數(shù)平板和滾管內(nèi)菌落數(shù)。大腸桿菌選用伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，乳酸菌用MRS瓊脂培養(yǎng)基，總需氧菌用普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（培養(yǎng)基由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SAS（1998）軟件的統(tǒng)計程序進(jìn)行方差分析和鄧肯氏多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖對肉牛血液生化指標(biāo)的影響

2.1.1 殼聚糖對肉牛脂代謝相關(guān)指標(biāo)的影響(見表2)

表2 殼聚糖對肉牛血清脂代謝相關(guān)指標(biāo)的影響(mmol/ml)

從表2可知，試驗(yàn)前、中期殼聚糖組肉牛血清中TG含量均低于對照組，并且在前期組間差異趨于顯著（P=0.10）。試驗(yàn)后期，1 000 mg/kg殼聚糖組最低，但組間差異不顯著。試驗(yàn)各期500 mg/kg殼聚糖組肉牛血清中TC含量均低于對照組，并且在試驗(yàn)前期組間差異趨于顯著水平(P=0.09)。試驗(yàn)后期1 000 mg/kg殼聚糖組TC含量低于對照組和500 mg/kg殼聚糖組,但組間差異不顯著(P＞0.05)。除試驗(yàn)中期LDL-C外，試驗(yàn)各期均以1 000 mg/kg殼聚糖組肉牛血清中HDL-C/TC、HDL-C/LDL-C和HDL-C含量為最高，LDL-C含量最低，但組間差異未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。

2.1.2 殼聚糖對肉牛內(nèi)分泌指標(biāo)的影響(見表3)

從表3可知，試驗(yàn)各期殼聚糖組肉牛血清中ACTH含量均低于對照組，甚至在試驗(yàn)后期組間差異趨于顯著(P=0.06)。然而，兩個殼聚糖組間無顯著差異。試驗(yàn)前、中期500 mg/kg殼聚糖組肉牛血清中CORT含量最低，試驗(yàn)后期則對照組最低，但組間差異不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)前期500 mg/kg殼聚糖組肉牛血清中GH含量顯著高于對照組（P＜0.05），試驗(yàn)后期，殼聚糖組的血清GH高于對照組，且差異水平趨于顯著（P=0.088），而試驗(yàn)中期未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。1 000 mg/kg殼聚糖組肉牛血清中GH含量低于500 mg/kg殼聚糖組，但組間差異不顯著。試驗(yàn)各期殼聚糖組肉牛血清中IGF-1含量均高于對照組，但組間差異不顯著(P＞0.05)。兩個殼聚糖組間差異很小，未顯現(xiàn)劑量效應(yīng)。除試驗(yàn)中期T4外，試驗(yàn)各期500 mg/kg殼聚糖組肉牛血清中T3、T4含量均高于對照組。然而，1 000 mg/kg殼聚糖組T3、T4均低于500 mg/kg殼聚糖組，有時略低于對照組。

表3 殼聚糖對肉牛血清應(yīng)激激素的影響(pg/ml)

2.1.3 殼聚糖對肉牛其它血液生化指標(biāo)的影響（見表4）

表4 殼聚糖對肉牛血清鈣磷水平及血清尿素氮的影響(mmol/ml)

從表4可知，試驗(yàn)各期500 mg/kg殼聚糖組肉牛血清中鈣含量低于對照組，但組間差異不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)各期1 000 mg/kg殼聚糖組肉牛血清鈣含量略低于對照組，并且在試驗(yàn)前期組間差異達(dá)到顯著（P=0.05）水平。與對照組相比，試驗(yàn)前期500 mg/kg殼聚糖組肉牛血清磷含量升高，而試驗(yàn)中期1 000 mg/kg殼聚糖組升高，但組間差異不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)后期對照組肉牛血磷水平較高，但組間差異不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)各期500 mg/kg殼聚糖組肉牛血清尿素氮水平均高于對照組，但組間差異不顯著（P＞0.05）。兩個殼聚糖組間也幾乎無差異，并未顯現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。

2.1.4 殼聚糖對肉牛后腸道微生物的影響(見表5)

表5 殼聚糖對肉牛后腸道微生物的影響(LogCFU/g)

從表5可知，在試驗(yàn)第42、70 d各日糧組肉牛的后腸道大腸桿菌在各試驗(yàn)階段也未顯現(xiàn)顯著的組間差異(P＞0.05)，但是500 mg/kg殼聚糖均不同程度地低于對照組，第42、70 d分別比對照組降低了6.76%、6.03%。試驗(yàn)第42 d時，500 mg/kg殼聚糖組乳酸菌含量顯著高于對照組和1 000 mg/kg殼聚糖組（P＜0.05），1 000 mg/kg殼聚糖組也略高于對照組。試驗(yàn)第70 d時組間無顯著差異，但是添加殼聚糖的各處理組仍不同程度高于對照組，與對照組相比，1 000 mg/kg殼聚糖組高14.84%，500 mg/kg殼聚糖組高10.99%。各處理組間總需氧菌均未表現(xiàn)出顯著的組間差異(P＞0.05)。

3 討論

3.1 殼聚糖對肉牛血液生化指標(biāo)的影響

3.1.1 殼聚糖對肉牛脂代謝的影響

殼聚糖進(jìn)入腸道后因其具有吸水性而體積越發(fā)增大，并不斷結(jié)合脂類顆粒，被結(jié)合的脂類不會被消化酶水解而直接排出體外，從而促進(jìn)了甘油三酯和膽固醇等脂類物質(zhì)的排泄。高密度脂蛋白會攝取血管內(nèi)膜層沉淀的膽固醇等有害物質(zhì)后運(yùn)到肝臟進(jìn)行代謝處理，所以其含量在一定范圍內(nèi)越高越好。而低密度脂蛋白會攜帶膽固醇到達(dá)全身各細(xì)胞，其含量不宜過高。然而，HDL-C/TC和HDL-C/LDL-C的增高能更精確的反映機(jī)體脂代謝情況。本試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)前、中期殼聚糖組肉牛血清中TG含量及試驗(yàn)前期TC含量有所降低，試驗(yàn)后期1 000 mg/kg殼聚糖組HDL-C/LDLC、HDL-C/TC都有所升高，且效果優(yōu)于500 mg/kg組。這說明殼聚糖對肉牛脂代謝有一定的調(diào)節(jié)作用，并且其調(diào)脂作用與添加劑量有關(guān)。

3.1.2 殼聚糖對肉牛血清內(nèi)分泌指標(biāo)的影響

HPA軸是機(jī)體重要的應(yīng)激感應(yīng)系統(tǒng)之一，隨著刺激增強(qiáng)HPA軸的反應(yīng)也增強(qiáng)，表現(xiàn)為ACTH、CORT的分泌增加，因此，血清中這兩種激素含量的變化能夠反映動物的應(yīng)激狀態(tài)。李慧英等在肉仔雞日糧中添加殼聚糖試驗(yàn)研究表明，殼聚糖對血清ACTH和CORT含量的影響呈顯著二次曲線降低趨勢，以500～1 000 mg/kg殼聚糖組含量最低。本試驗(yàn)后期殼聚糖組肉牛血清中ACTH含量顯著低于對照組，這表明殼聚糖通過降低ACTH含量緩解肉牛的應(yīng)激狀態(tài)。

GH/IGF-1是生長軸的重要組成部分，調(diào)控動物的蛋白質(zhì)、糖和脂肪代謝，從而直接或間接的影響機(jī)體生長。然而，只有適量甲狀腺素的存在才能使生長激素起到促生長作用。Zhang等（2008）研究表明，日糧添加0.01%～0.05%殼聚糖可增加仔豬血清GH和IGF-1含量，但是添加量達(dá)到0.1%時顯現(xiàn)出負(fù)效應(yīng)，說明殼聚糖對仔豬血清生長激素的影響具有劑量依賴效應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，500 mg/kg殼聚糖使肉牛血清T3含量有所升高，也顯著增加了肉牛血清中GH含量，并可在一定程度上增加了IGF-1含量。1 000 mg/kg殼聚糖添加組肉牛血清中GH含量低于500 mg/kg添加組，并且與對照組無顯著差異，這與前人研究結(jié)果一致，殼聚糖促生長作用呈劑量依賴效應(yīng)。

3.1.3 殼聚糖對肉牛其他血液生化指標(biāo)的影響

雖然血清中的鈣磷含量較低，但在維持機(jī)體正常的生命活動中發(fā)揮著重要作用。血清尿素氮含量的多少反映著血清中的氨基酸合成蛋白質(zhì)的效率。殼聚糖對動物鈣磷水平及血清尿素氮的影響研究目前還很少見。丁曉嵐（2005）研究表明，殼聚糖對肉仔雞鈣磷水平的影響不一致，較低劑量殼聚糖組血清鈣水平較高，較高劑量組血清磷水平較高。任海軍等（2008）研究表明，殼聚糖對奶牛血清尿素氮水平無顯著影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，較高劑量（1 000 mg/kg）的殼聚糖可降低肉牛血清鈣水平，增加血清磷含量；殼聚糖也可提高肉牛血清中尿素氮水平，但組間差異未達(dá)到顯著水平。這與以上兩人的的研究結(jié)果相符。

3.2 殼聚糖對肉牛后腸道微生物的影響

殼聚糖被動物采食后不被機(jī)體的消化酶分解，而是直接到達(dá)腸道后被乳酸菌等有益菌利用，促進(jìn)有益菌的生長定殖，形成一道非特異性防御屏障，抑制侵入的某些病原微生物生長，從而維持機(jī)體微生態(tài)平衡，利于機(jī)體健康及生長，提高動物生產(chǎn)性能。研究表明殼聚糖可抑制腸道大腸桿菌，促進(jìn)乳酸菌和雙歧桿菌等有益菌的增殖。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，殼聚糖對肉牛后腸道大腸桿菌有一定的抑制作用，可顯著促進(jìn)乳酸菌增殖，從而改善肉牛的腸道微生態(tài)。

4 結(jié)論

①日糧添加1 000 mg/kg殼聚糖使肉牛血清中TG、TC、、LDL-C及Ca含量有所降低，HDL-C/TC、HDL-C/LDL-C、HDL-C及P含量有所升高，對肉牛的脂代謝和鈣磷水平產(chǎn)生影響。

②日糧殼聚糖可降低肉牛血清中ACTH水平，提高GH水平，緩解肉牛應(yīng)激狀態(tài)。

③殼聚糖能夠促進(jìn)肉牛后腸道乳酸菌的增殖，改善后腸道微生態(tài)環(huán)境。

（參考文獻(xiàn)12篇，刊略，需者可函索）