乙酸對奶牛乳腺上皮細胞活力及CD36和FABP3基因表達的影響

■齊利枝 閆素梅 生 冉 趙艷麗 金 鹿

(內蒙古農業(yè)大學動物科學學院，內蒙古呼和浩特 010018)

乳腺中約50%的脂肪酸來源于乙酸等乳脂前體物在乳腺內的從頭合成，主要包括中短鏈脂肪酸（C4∶0～C14∶0）及50%的C16∶0；長鏈脂肪酸（C18∶0及50%的C16∶0）除油酸是乳腺中由硬脂酸通過△9-去飽和酶系統(tǒng)產生外，其余均來自日糧[1]。乳脂是最容易受到遺傳、生理和日糧等因素影響而發(fā)生改變的乳成分。研究已經證實乙酸等用于從頭合成的乳脂前體物與外源供給的長鏈脂肪酸（LCFA）對乳脂肪的合成有直接的影響，日糧中增加LCFA的供給對脂肪酸的從頭合成有顯著的抑制作用，增加中、短鏈脂肪酸（SMCFA）的供給可以減少用于從頭合成的短鏈脂肪酸（SCFA），可提高乳脂含量，改變其脂肪酸組成[2]。因此，深入探討乳脂前體物對乳脂肪合成的影響機理對不斷改善乳脂組成及乳品質有重要意義。乙酸作為奶牛乳腺脂肪酸內源合成的主要前體物，體外研究結果表明，其可以促進奶牛乳腺上皮細胞甘油三酯（TAG）合成?？讘c洋等[3]研究了不同濃度的乙酸鈉對奶牛乳腺上皮細胞胞外TAG濃度的影響，結果表明，隨著乙酸添加劑量的增加，TAG濃度顯著增加。Maxin等（2011）[4]的研究表明，瘤胃灌注乙酸處理組乳脂率增加了6.5%，而且改變了乳脂組成。提示乙酸對乳脂合成有一定的影響，但其機制仍然不清楚。分化抗原簇36（CD36）參與乳脂分泌，但其更重要的作用是轉運脂肪酸進入奶牛乳腺細胞(Bionaz等，2008a)[5]。脂肪酸結合蛋白3（FABP3）參與細胞內脂肪酸的轉運，并且在泌乳期奶牛乳腺中的FABP3 mRNA的相對表達量上調(Bionaz和Loor，2008b)[6]。因此，乙酸對乳脂肪合成的影響可能與CD36和FABP3 mRNA的基因表達有關，而關于這方面的研究較少。本試驗主要研究乙酸對奶牛乳腺上皮細胞活力及CD36和FABP3 mRNA相對表達量的影響，為進一步研究乙酸對乳脂肪合成的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DMEM/FA12培養(yǎng)基(Gibco，美國)、胎牛血清（FBS，Gibco，美國）、無脂肪酸牛血清白蛋白(BSA，Equitech-Bio，美國）、催乳素(Gibco，美國)、表皮生長因子(Gibco，美國)、胰蛋白酶(Gibco，美國)、胰島素轉鐵蛋白(Gibco，美國)、雙抗(Gibco，美國)、乙二胺四乙酸（EDTA，Gibco，美國）、氫化可的松（Sig?ma，美國）、噻唑藍（MTT，Sigma，美國）、二甲基亞砜(DMSO，Sigma，美國)、乙酸鈉（Sigma，美國）、RNAprep pure Cell/Bacteria Kit（TIANGEN，北京）、PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa，大連)和 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa，大連)。實時定量PCR儀（Roche，瑞士）、酶標儀（Biotek，美國）、倒置顯微鏡（Olympuse，日本）。

1.2 乳腺上皮細胞的培養(yǎng)

采用膠原酶消化法獲得乳腺上皮細胞。選取健康的荷斯坦奶牛，取其乳腺組織，去除組織外層，剪取若干約1 cm3的組織塊，置于預冷的PBS溶液中。在無菌超凈臺中將組織塊用PBS洗凈后，去除組織塊表層將其剪成糊狀。加入0.5%膠原酶Ⅱ溶液，置于37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中消化1 h，每20 min輕搖離心管。然后用孔徑80目的細胞濾網(wǎng)進行過濾，收集細胞濾液，1 500 r/min離心5 min，棄掉上清液，加入含有10%FBS的DMEM/F12細胞培養(yǎng)液，用移液槍吹打均勻，接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞的融合度為80%～90%時，用胰蛋白酶消化處理乳腺上皮細胞并進行傳代。本試驗采用第3代細胞。

1.3 試驗設計

將傳第3代的乳腺上皮細胞懸液接種于細胞培養(yǎng)板上，每孔加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)48 h的奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)孔隨機分為1個對照組和5個試驗組。每組分別加入含0、4、6、8、10、12 mmol/l乙酸（以乙酸鈉的形式添加）的DMEM/F12培養(yǎng)液，并用1 g/l無脂肪酸的BSA替代培養(yǎng)液中的FBS，其中0 mmol/l為對照組。置于37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 測試指標與方法

1.4.1 細胞活力

細胞活力的檢測采用MTT法，以細胞相對增殖率（Relative Growth Rate,RGR）表示。在細胞培養(yǎng)結束前4 h，每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml）；4 h后棄上清液，每孔加入100 μl DMSO，振蕩10 min后，用全自動酶標儀（Synergy H4 Reader）在490 nm波長下檢測各培養(yǎng)孔的吸光值（OD490）。RGR=（試驗組OD490/對照組OD490）×100%。每個處理4個重復。

1.4.2 乳腺上皮細胞內FABP3和CD36 mRNA的表達

乳腺上皮細胞內FABP3和CD36 mRNA相對表達量采用實時熒光定量PCR法檢測。將每孔1×105細胞懸浮液接種于6孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)48 h，在每孔加入含有不同濃度乙酸的誘導培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，提取RNA。細胞RNA的提取、反轉錄和熒光定量PCR分別采用RNAprep pure Cell/Bacteria Kit試劑盒、PrimeScript?RT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行操作。選用管家基因磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內參基因，引物見表1。實時熒光定量PCR的反應程序為：95.0 ℃、30 s；95.0 ℃、30 s，Tm 30 s，72.0 ℃20 s，40cycles；72 ℃、7 min；溶解曲線程序為：70～95℃，每6 s升高0.5℃,51cycles。每個處理組6個重復。采用2-△△Ct法進行相對定量數(shù)據(jù)分析[7]。

表1 Primer sequence

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SAS（SAS 9.0）軟件的回歸統(tǒng)計程序進行，對不同濃度的乙酸處理效應進行一次線性和二次曲線回歸分析，P＜0.05表示差異顯著，

0.05＜P＜0.10表示差異趨于顯著。

2 結果與分析

2.1 添加乙酸對奶牛乳腺上皮細胞活力的影響（見表2）

表2 乙酸對奶牛乳腺上皮細胞活力的影響

如表2所示，4～10 mmol/l的所有乙酸處理組RGR均高于對照組，其中，以4～8 mmol/l乙酸處理組較高。當乙酸濃度增加到12 mmol/l時，RGR降低，并低于對照組?；貧w分析結果表明，隨著乙酸濃度的增加RGR呈二次曲線增加，二者呈顯著的劑量依賴關系(P=0.005)，回歸方程為y=-0.006 85x2+0.071 15x+1.000 48，R2=0.970 6；其中x為乙酸添加水平，y為RGR。這些結果提示低濃度的乙酸可促進奶牛乳腺上皮細胞活力，而高濃度則表現(xiàn)出抑制作用。

2.2 添加乙酸對奶牛乳腺上皮細胞FABP3和CD36 mRNA相對表達量的影響（見表3）

表3 乙酸對奶牛乳腺上皮細胞CD36和FABP3 mRNA相對表達量的影響

從表3可以看出，添加不同濃度的乙酸均下調了CD36 mRNA相對表達量，且以8～12 mmol/l乙酸組CD36的表達量較低。FABP3表達量的結果正好相反，即4～12 mmol/l的所有乙酸處理組FABP3基因表達量均不同程度高于對照組，其中以10～12 mmol/l乙酸組表達量較高。從回歸統(tǒng)計結果看，CD36的相對表達量隨著乙酸添加濃度的增加呈顯著的一次線性（P=0.011）和二次曲線（P=0.000）降低，回歸方程為:y=-0.038 59x+0.903 89，R2=0.831 0；y=0.004 55x2-0.093 14x+1.122 93，R2=0.994 82；其中x為乙酸添加水平，y為CD36 mRNA相對表達量。隨著乙酸添加濃度的增加，F(xiàn)ABP3的表達量呈顯著的一次線性(P=0.001)和二次曲線(P=0.010)增加，回歸方程為:y=0.247 44x+0.98 84，R2=0.945 0；y=0.006 75x2+0.166 38x+1.122 93，R2=0.955 2；其中X為乙酸添加水平，y為FABP3 mRNA相對表達量。說明乙酸的添加可下調CD36的基因表達量，上調FABP3表達量。

3 討論

細胞活力是用來反映細胞存活和增殖的指標。本研究結果發(fā)現(xiàn)，乙酸作為脂肪酸內源合成的主要前體物和主要能源物質，對奶牛乳腺上皮細胞活力有一定的調節(jié)作用，二者呈劑量依賴關系，低濃度的乙酸可促進奶牛乳腺上皮細胞活力，而高濃度則表現(xiàn)出抑制作用。目前關于乙酸對奶牛乳腺上皮細胞活力的研究尚未見報道，其機理還需要進一步探討。

FABP和CD36是奶牛乳腺中兩種主要的LCFA轉運蛋白，在牛乳腺中FABP和CD36的共表達提示這兩種蛋白存在相近的功能關系(Spitsberg等,1995)[10]。在奶牛乳腺組織中FABP3、FABP4和FABP5三種異構體的mRNA表達量較高，在泌乳階段FABP3 mRNA表達量最高(Bionaz和Loor,2008b)[6]。FABP3參與細胞內LCFA的轉運，CD36主要將脂肪酸轉運進入乳腺細胞，二者與乳腺上皮細胞對長鏈脂肪酸的攝取與轉運有關。然而，目前關于乙酸對FABP3和CD36基因表達的研究極少。Yonezawa等（2004）在奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)液中分別添加10 mmol/l乙酸、丁酸或辛酸，研究結果表明，辛酸顯著上調了細胞中CD36 mRNA表達量，但乙酸和丁酸對CD36表達量的促進作用遠低于辛酸，并提示乙酸、丁酸或辛酸CD36表達量的上調作用似乎與碳原子的數(shù)量有關[11]。Storry等（1965）[12]體內試驗的研究結果表明，瘤胃灌注乙酸增加了乳脂中C4-C16脂肪酸的量，而降低了所有C18脂肪酸的量。崔海（2011）[2]的研究結果也表明，在奶牛日糧中添加SMCFA，乳脂中C10∶0、C12∶0、C14∶0、C14∶1、C16∶0和C14∶1含量增加，除了c9-C18∶1外其它C18脂肪酸含量均增加。這些結果提示，外源補充乙酸鈉降低了乳脂中長鏈脂肪酸的量，即降低了乳脂中來源于外源供給的LCFA的比例。本試驗的研究結果表明，不同濃度的乙酸處理組均下調了CD36 mRNA相對表達量。這一結果可能解釋了外源補充乙酸鈉是通過下調脂肪酸轉運蛋白CD36 mRNA表達量，影響乳腺上皮細胞對LCFA的攝取進而引起乳脂中LCFA的合成受限。然而，本試驗的結果也表明，F(xiàn)ABP3的mRNA表達量隨著乙酸添加濃度的增加而增加，與CD36的表達量結果相反。FABP3和CD36盡管都是LCFA的轉運蛋白，但前者主要與細胞內的轉運有關，后者與細胞的攝取有關，其功能并不相同，因此乙酸鈉對這兩種轉運蛋白基因表達量的調節(jié)作用并不矛盾。目前關于該領域的研究甚少，還需要進一步探討。

4 結論

①乳腺上皮細胞活力與乙酸濃度呈顯著的二次劑量依賴關系，低濃度的乙酸可促進奶牛乳腺上皮細胞活力，而高濃度則表現(xiàn)出抑制作用。

②不同濃度的乙酸處理均下調了CD36 mRNA相對表達量，上調了FABP3 mRNA表達量。