原料乳中菌落總數(shù)檢測方法的比較研究

■張名愛 李潔慧 于翠芳 杜中彩

(青島農(nóng)業(yè)大學，山東青島 266109)

隨著近年來我國經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活水平的提高以及乳制品（尤其是牛乳）需求量的增加，對牛乳及其乳制品的質(zhì)量要求也越來越高。據(jù)統(tǒng)計，到2010年，我國人均奶類食品攝入量達到16 kg，比2000年增加一倍以上，由此看出中國的乳制品消費市場潛力巨大[1]。隨著微生物學檢測技術的發(fā)展，產(chǎn)生了許多關于菌落總數(shù)測定的新技術、新儀器、新方法和新標準。

菌落總數(shù)用于判定食品被細菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，是鮮牛奶重要的質(zhì)量控制指標之一（鮮牛奶中細菌數(shù)要求低于2×105個/ml[2]），在一定程度上標志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣，它反映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求，以便對被檢樣品做出恰當?shù)男l(wèi)生學評價[3]。本次試驗對常規(guī)檢驗的3種方法進行比較研究，以期獲得理想的并能適應不同具體情況的檢驗方法，為食品質(zhì)量檢驗部門和乳品企業(yè)中菌落總數(shù)的檢測提供參考，并為檢測標準的修改提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器設備

1.1.1 試驗材料

原料乳：購自農(nóng)場。

葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂、KH2PO4、NaOH及其他藥品均為國產(chǎn)。

1.1.2 儀器與設備

PYX-DHS-40×50-13-Ⅱ隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：龍口市先科儀器公司生產(chǎn)；HPS-250生化培養(yǎng)箱：哈爾濱市東明醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；HW.SY21-K電熱恒溫水浴鍋：龍口市電爐制造廠生產(chǎn)；YXQG02型電熱式滅菌鍋：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司生產(chǎn)；PHS-3C精密pH計：上海雷磁儀器廠生產(chǎn)；TB-214電子分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)；電子調(diào)溫萬用爐：龍口市先科儀器公司生產(chǎn)；DGX-9243B-1電熱鼓風干燥箱：上海?，斣囼炘O備有限公司生產(chǎn)；DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：廣東銀港科技股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 檢驗程序

檢樣→10倍系列稀釋→3個適宜樣品液，各1 ml加入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)→每皿加入15～20 ml培養(yǎng)基，混勻→倒置培養(yǎng)→計數(shù)。

1.2.2 三種標準測定方法比較[4-7]

表1 三種標準的主要區(qū)別

1.2.3 測定

①原料乳的稀釋

取4個不同批次的原料乳，分別編號為S1、S2、S3、S4。取25 ml原料乳樣品于225 ml稀釋液中，充分混勻，制成10-1的樣品液。取10-1樣品液1 ml，沿管壁緩慢注于9 ml稀釋液中，混合均勻，制成10-2的樣品液，并依次制成10-3、10-4、10-5三個稀釋度的樣品液。從制備最初的稀釋液至傾倒培養(yǎng)基時間間隔不宜超過15 min。

②接種培養(yǎng)

分別取10-3、10-4、10-5稀釋度的樣品液1 ml，傾注接種。每個梯度每種培養(yǎng)基做2個平板，同時做空白對照。待瓊脂凝固后，倒置培養(yǎng)。

③計數(shù)

選取無蔓延菌落生長的平板用于計數(shù)。培養(yǎng)后每24 h計數(shù)，連續(xù)72 h。

2 結果與分析

2.1 平皿計數(shù)結果

根據(jù)三種標準菌落總數(shù)測定方法對4個批次原料乳細菌總數(shù)的測定結果見表2。

表2 平皿計數(shù)結果

由表2結果看出，培養(yǎng)基和稀釋液等條件相同，培養(yǎng)溫度不同時，F(xiàn)DA BAM-2001的檢測結果普遍高于GB/T 4789.2—2010；培養(yǎng)相同時間，菌落總數(shù)測定結果的總體情況為：IDF 100A：1987＜GB/T 4789.2—2010＜FDA BAM—2001；由此可知，35 ℃更適合原料乳中細菌的生長繁殖，檢出率更高。

2.2 三種方法測定結果的比較

菌落計數(shù)報告及三種方法之間的比較見表3。

表3 菌落總數(shù)

對表3結果進行比較分析，IDF 100A：1987檢出率顯著高于GB/T 4789.2—2010和FDA BAM—2001方法，IDF 100A：1987檢出率為GB/T 4789.2—2010的2.2倍左右，F(xiàn)DA BAM—2001檢出率大約為GB/T 4789.2—2010檢出率的1.5倍左右。

2.3 差異顯著性分析

對三種檢測方法測定結果進行顯著性分析，結果見表4。

表4 方差分析

根據(jù)統(tǒng)計學數(shù)據(jù)分析，4種樣品間F=0.33＜1，即P＞0.05，樣品間無顯著差異，說明該測定結果適用于不同樣品的檢測；三種方法間F=2.09＞F0.05，即P＜0.05，三種方法測定結果存在顯著差異，即IDF 100A：1987＞FDA BAM—2001＞GB/T 4789.2—2010。

2.4 測定結果分析

對表2、表3、表4測定結果進行比較分析，IDF 100A：1987檢出率最高，營養(yǎng)全面，菌落易于分辨，缺點是檢驗周期長；FDA BAM—2001優(yōu)于GB/T 4789.2—2010，其共同優(yōu)點是方法簡單，檢驗周期短。檢驗方法中影響檢驗結果的主要因素包括培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、計數(shù)方法等。

2.4.1 培養(yǎng)基成分

培養(yǎng)基的營養(yǎng)構成為細菌的生長繁殖提供了必需的碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽和水等營養(yǎng)元素。GB/T 4789.2—2010和FDA BAM—2001使用的培養(yǎng)基均為平板計數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基，與世界乳品聯(lián)合會國際標準IDF 100A：1987使用的IDF培養(yǎng)基相比，IDF 100A：1987培養(yǎng)基的營養(yǎng)更全面，利于細菌的生長繁殖，對檢出率的提高起了主要作用，而且其培養(yǎng)基顏色淺，易于計數(shù)，流動性好，容易與樣品稀釋液混勻。說明在菌落計數(shù)中，IDF培養(yǎng)基要優(yōu)于平板計數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基。

2.4.2 培養(yǎng)溫度

由于各種食品中所分布的細菌種類不同，其最佳檢測溫度也不盡相同[8]。實驗采用的三種檢測標準中使用的培養(yǎng)溫度分別為37、30、35℃。其中，GB/T 4789.2—2010和FDA BAM—2001的主要區(qū)別在于計數(shù)范圍和培養(yǎng)溫度，由表2結果表明，35℃條件下菌落總數(shù)的檢出率高于37℃，35℃更適于原料乳中細菌的生長。

2.4.3 培養(yǎng)時間

從培養(yǎng)周期看，培養(yǎng)時間越長，同類別微生物生長繁殖的代數(shù)越多，數(shù)量也就越多。GB/T 4789.2—2010和FDA BAM—2001的培養(yǎng)周期短為48 h，而IDF 100A：1987為72 h，這可能也是表3結果中IDF 100A：1987檢出率高于GB/T 4789.2—2010和FDA BAM—2001的原因。但培養(yǎng)周期太長，不利于快速、大批量的檢測。

2.4.4 稀釋液

培養(yǎng)介質(zhì)對細菌增長有一定影響，GB/T 4789.2—2010和FDA BAM—2001采用的稀釋液為磷酸鹽緩沖溶液或生理鹽水，IDF 100A：1987采用蛋白胨溶液。蛋白胨溶液中含有較多有利于細菌生長的營養(yǎng)物質(zhì)，并且對食品中已受損的細菌細胞有一定的保護作用[9]，而且檢樣稀釋至傾注平板在15 min內(nèi)完成，時間較短，對菌落檢出率的影響可忽略不計。因此在制備樣品稀釋液時，采用蛋白胨溶液要比磷酸鹽緩沖液或生理鹽水更能提高菌落總數(shù)的檢出率。

2.4.5 計數(shù)范圍

計數(shù)范圍的選擇在很大程度上也會影響檢出率。理論上講，計數(shù)范圍越小，會使檢測結果偏小。三種檢測方法的計數(shù)范圍分別為：GB/T 4789.2—2010 30～300 CFU，IDF 100A：1987 10～300 CFU，F(xiàn)DA BAM—2001 25～250 CFU。試驗結果顯示，IDF 100A：1987的檢測結果最大，與預測結果基本吻合。

3 小結

原料乳中菌落總數(shù)的測定方法有多種，而對于培養(yǎng)溫度的選擇應選擇兼顧體溫型和室溫型兩類微生物，國外采用35℃是偏體溫型，采用30℃是偏室溫型，而國內(nèi)統(tǒng)一選擇37℃應用于所有食品[10]，在一定程度上不利于微生物的檢出。通過對GB/T 4789.2—2010，IDF 100A：1987和FDA BAM—2001中規(guī)定的菌落總數(shù)測定方法進行比較分析發(fā)現(xiàn)，三種標準的測定結果間存在顯著性差異，其中，IDF 100A：1987方法中培養(yǎng)基成分的營養(yǎng)全面，檢出率最高，但檢驗周期較長，不利于快速檢測；在培養(yǎng)時間相同、培養(yǎng)基成分相同時，F(xiàn)DA BAM—2001的檢出率高于GB/T 4789.2—2010，說明培養(yǎng)溫度為35℃時，更有利于原料乳中細菌的生長，便于菌落總數(shù)的檢出；在原料乳的檢測上，GB/T 4789.2—2010的檢出率略低于IDF 100A：1987和FDA BAM—2001。