利用生物制劑破解秸稈抗?fàn)I養(yǎng)因子的研究進(jìn)展

■張立霞 刁其玉 李艷玲 屠 焰

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081）

農(nóng)作物秸稈是僅次于煤、油、氣的第四大能源，是一種非常重要的可再生生物質(zhì)資源。我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，有著極其豐富的農(nóng)作物秸稈資源，每年全世界秸稈產(chǎn)量有30億噸之多。2009年我國(guó)農(nóng)作物收獲后剩余的秸稈產(chǎn)量高達(dá)7.4億噸，位居世界前列[1]。但是由于農(nóng)作物秸稈理化性質(zhì)的特殊性，其作為飼料有很多的限制性。秸稈質(zhì)地比較粗硬、適口性不好、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較差、消化利用率比較低等，只有很少一部分能被用來飼養(yǎng)草食動(dòng)物。單胃動(dòng)物一般不能利用秸稈，反芻動(dòng)物對(duì)秸稈的消化率也只是僅有20%～30%[2]。如何提高秸稈資源的利用是一項(xiàng)長(zhǎng)期被關(guān)注的事情。近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)如何有效提高秸稈利用率進(jìn)行了大量的研究，常用的方法主要有物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)法和生物法。其中物理處理包括粉碎、軟化、爆破、顆粒化技術(shù)等，化學(xué)處理包括氨化、氧化、酸堿化處理等，物理處理只是改變了秸稈的物理性狀，并沒有改變秸稈本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)，

不能解決秸稈消化率低和可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)少的根本問題；化學(xué)處理生產(chǎn)成本較高，經(jīng)處理后化學(xué)離子流失到環(huán)境中，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重[3]，而生物法主要是酶處理和益生菌處理，這種處理既不需太復(fù)雜的設(shè)備和過多的能量等消耗，也不需要高溫、高壓、強(qiáng)堿和強(qiáng)酸等條件，只依靠益生菌和酶制劑的生物降解能力來降解秸稈中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，具有能耗低，污染小，易于操作等優(yōu)點(diǎn)[4]。研究結(jié)果表明，微生物及其代謝產(chǎn)物具有破解秸稈纖維結(jié)構(gòu)的功能，故利用生物技術(shù)提高秸稈利用率得到廣泛關(guān)注。

1 農(nóng)作物秸稈主要化學(xué)成分

1.1 三種主要農(nóng)作物秸稈的化學(xué)成分

表1 三種主要農(nóng)作物秸稈中主要成分含量(%)

農(nóng)作物秸稈是收獲作物主產(chǎn)品之后所有大田剩余的副產(chǎn)物及主產(chǎn)品初加工過程產(chǎn)生的副產(chǎn)物，包括一些禾本科作物和豆科作物的秸稈，如小麥秸、玉米秸、大豆秸等[6-7]。秸稈中幾乎能夠被完全消化的是細(xì)胞內(nèi)容物，細(xì)胞壁因含有較多的粗纖維，導(dǎo)致在動(dòng)物體內(nèi)消化緩慢且不完全。細(xì)胞壁的主要成分是粗纖維，粗纖維中的纖維素被木質(zhì)素和半纖維素包裹著，木質(zhì)素有著堅(jiān)硬的外殼，木質(zhì)素與纖維素、半纖維素等之間也有酚酸相連接，微生物和酶制劑均不易接觸到纖維素，因此纖維素的分解受到限制[8]。為了提高秸稈的利用，就需要采用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)原料進(jìn)行處理，達(dá)到降解木質(zhì)素，提高秸稈利用率的目的。

1.2 農(nóng)作物秸稈的結(jié)構(gòu)組成

農(nóng)作物秸稈由細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)容物組成，其中細(xì)胞壁所占的比例一般都在80%以上[9]。細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素、蛋白質(zhì)和木質(zhì)素組成。這些聚合體與少量的如乙酞基和酚酸化合物，一同構(gòu)成了復(fù)雜的三維立體結(jié)構(gòu)。其他成分如角質(zhì)、單寧、蠟質(zhì)和礦物質(zhì)等，也是細(xì)胞壁的組成成分。細(xì)胞內(nèi)容物主要是一些可溶性的碳水化合物、部分蛋白質(zhì)等。

細(xì)胞壁是圍繞在植物原生質(zhì)體外的一種復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，是具有一定彈性和硬度、參與維持細(xì)胞的形態(tài)、增強(qiáng)細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度的重要結(jié)構(gòu)[10]。作物秸稈的細(xì)胞壁是植物細(xì)胞的重要組成部分，在秸稈細(xì)胞中所占比例也最大，其中含有的結(jié)構(gòu)性多糖類是反芻動(dòng)物所能利用的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[11]。

在秸稈細(xì)胞壁中，主要成分是纖維素。它是由葡萄糖單位之間以糖苷鍵連接而成的無分支聚合體，以反式連接相連，從而形成扁帶狀的微纖維狀。在自然界中纖維素即以這種微纖維組成的結(jié)晶狀態(tài)存在。微纖維之間又有氫鍵連接，可以與半纖維素相連。一般情況下，纖維素化學(xué)性能穩(wěn)定，但在高溫高壓和酸性的條件下，可以水解為葡萄糖[12]。在反芻動(dòng)物體內(nèi)，其胃腸道中共生的微生物能夠分泌纖維素酶等，將纖維素降解成乙酸、丙酸、丁酸等，因而能被反芻動(dòng)物利用。

半纖維素在細(xì)胞壁中含量?jī)H次于纖維素，在細(xì)胞壁中通過氫鍵與纖維素以及通過共價(jià)鍵與木質(zhì)素相連接。半纖維素主要包括聚木糖類、聚葡萄甘露糖類和聚半乳糖葡萄甘露糖類三大類[13]。禾本科植物中半纖維素的主要成分是聚木聚糖類，它通過β-1，4木糖殘基連接而成的木聚糖骨架和支鏈形成。木聚糖單元在C2或C3位置可被乙酸、阿拉伯糖等取代，進(jìn)而形成支鏈。半纖維素覆蓋在纖維素微纖絲之外并通過氫鍵將微纖絲交聯(lián)成復(fù)雜的網(wǎng)格，形成細(xì)胞壁內(nèi)高層次上的結(jié)構(gòu)。纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三者緊密結(jié)合，構(gòu)成植物細(xì)胞的主要成分[14]。

木質(zhì)素的基本結(jié)構(gòu)單元是苯丙烷，通過醚鍵和碳碳鍵連接形成復(fù)雜的無定形高聚物。典型木質(zhì)素是由松柏醇、芥子醇和對(duì)香豆醇這3種不同的醇作為先體物質(zhì)組成基本結(jié)構(gòu)。它能與半纖維素分子緊密交聯(lián)形成疏水的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，整個(gè)細(xì)胞壁就成為一個(gè)緊密的網(wǎng)狀，增加了細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度和對(duì)病原體的抵抗能力。與此同時(shí)，也阻礙了反芻動(dòng)物瘤胃微生物水解酶與細(xì)胞壁中纖維素和半纖維素接觸，從而降低纖維多糖的降解效率。因此木質(zhì)素被認(rèn)為是抑制秸稈利用率提高的主要限制性因素。玉米秸稈中木質(zhì)素含量可達(dá)到19%～23%，直接影響玉米秸稈的利用效率[15-17]。

我院70例高血壓患者進(jìn)行此次研究(2015年12月7日至2018年3月5日),以隨機(jī)基本原則為依據(jù),均分為兩組。

2 秸稈中的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子

理論上來講秸稈細(xì)胞壁可以完全被反芻動(dòng)物瘤胃微生物所降解，但是只有20%～30%才能被降解。反芻動(dòng)物瘤胃是一個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部含有能分泌纖維素酶、半纖維素酶等的微生物，可以降解纖維素和半纖維素，但是沒有直接降解木質(zhì)素的微生物，因此，木質(zhì)素成為影響農(nóng)作物秸稈降解的限制性因素[18]。除此，酚酸是植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在細(xì)胞壁中通過酯鍵或醚鍵與多糖和木質(zhì)素形成多種交聯(lián)。目前研究較多的酚酸主要是阿魏酸和香豆酸?，F(xiàn)在認(rèn)為阿魏酸、二聚阿魏酸、香豆酸及香豆酸與阿魏酸的比值也有可能是影響秸稈細(xì)胞壁的降解抗?fàn)I養(yǎng)因子[19]。

2.1 木質(zhì)素

木質(zhì)素不屬于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是植物細(xì)胞壁中最難降解的部分，但是卻直接影響飼料纖維物質(zhì)的降解率。木質(zhì)素對(duì)秸稈飼料降解有兩大抑制作用：一是木質(zhì)素與纖維素、半纖維素等的特殊交聯(lián)結(jié)構(gòu)限制了微生物和酶與多糖的接觸，抑制了纖維素等的消化；二是木質(zhì)素本身難以被降解，充盈在瘤胃內(nèi)，限制了動(dòng)物對(duì)干物質(zhì)的采食[20]。

2.2 阿魏酸

阿魏酸在植物不同生長(zhǎng)階段和不同組織部位含量不同。阿魏酸主要有兩個(gè)功能團(tuán)，羧酸基團(tuán)和酚酸羥基，阿魏酸通過酯鍵與多糖和醚鍵與木質(zhì)素相連，并且在木質(zhì)素和多糖間或多糖之間形成酯醚橋[21]，這些酯醚橋改變了秸稈細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度和延展性，并且降低了植物細(xì)胞壁多糖的降解效率。在植物細(xì)胞壁的形成過程中，阿魏酸逐漸沉積并且與多糖、木質(zhì)素等交聯(lián)，形成具有復(fù)雜酯醚交聯(lián)鍵的阿魏酸聚合物[22]。其實(shí)植物細(xì)胞壁的木質(zhì)化程度的提高即是以酯化的阿魏酸多聚糖作為起始位點(diǎn)和成核位點(diǎn)。因此，阿魏酸的存在能夠增加木質(zhì)素對(duì)植物消化率的抑制作用。阿魏酸也就成為影響秸稈消化率的重要因子。

2.3 阿魏酸二聚體

二聚阿魏酸被比作植物鋼制網(wǎng)架的焊接點(diǎn)。在相鄰多糖主鏈上的兩個(gè)阿魏酸分子間會(huì)形成化學(xué)鍵，而所形成的化學(xué)鍵是植物細(xì)胞壁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的重要部分。它能夠限制細(xì)胞壁的延伸，加固植物細(xì)胞壁，防止細(xì)胞壁被瘤胃微生物降解，因此降低了細(xì)胞壁的消化率。

2.4 香豆酸

香豆酸通過酯鍵和醚鍵與木質(zhì)素相連，只有少量的通過酯鍵與多糖相連（Sun等，2002）。大部分香豆酸會(huì)在植物次級(jí)細(xì)胞壁的形成過程中被吸收并進(jìn)入植物細(xì)胞壁，逐漸沉積并形成木質(zhì)素[23]。因此，香豆酸被認(rèn)為是反映植物細(xì)胞壁木質(zhì)化程度的指標(biāo)。

2.5 香豆酸和阿魏酸的比值

有的研究認(rèn)為這個(gè)比值與植物細(xì)胞壁消化率呈負(fù)相關(guān)[24]。但是有些研究認(rèn)為這個(gè)比值往往極少考慮阿魏酸對(duì)植物降解的抑制作用。目前，香豆酸和阿魏酸的比值與植物細(xì)胞壁降解率之間的關(guān)系仍然存在很大爭(zhēng)議。

3 降解農(nóng)作物秸稈的微生物及其分泌的酶類

3.1 微生物

3.1.1 細(xì)菌和放線菌

反芻動(dòng)物瘤胃微生物中細(xì)菌的種類最多，數(shù)量也最大。它們的功能也各不相同，主要有纖維素分解菌、半纖維素分解菌、淀粉降解菌、蛋白降解菌等，它們將動(dòng)物攝入的飼料轉(zhuǎn)化為可以吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。細(xì)菌一般比表面積比較大，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能夠快速的進(jìn)入細(xì)胞。因此，在瘤胃內(nèi)細(xì)菌往往多于真菌，產(chǎn)孢子的芽孢桿菌等還可以抵御惡劣的環(huán)境[25]。研究表明，一些細(xì)菌具有分解纖維素的能力[26]。三種主要分解纖維素的細(xì)菌是革蘭氏陽性菌琥珀酸絲狀桿菌和革蘭氏陰性菌、白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌。溶纖維丁酸弧菌具有木聚糖酶活性，可以降解木聚糖。普雷沃氏菌并不是高度降解纖維素的細(xì)菌，但是卻可以產(chǎn)生一系列的木聚糖酶。除此，部分細(xì)菌還可以降解半纖維素和木質(zhì)素[27]。

此外，放線菌也有降解木質(zhì)纖維素的能力，但是放線菌繁殖慢且對(duì)纖維素和木質(zhì)素等的降解率低。一般來說，放線菌比較容易利用半纖維素，對(duì)纖維素的利用較少，且能不同程度地改變木質(zhì)素的分子結(jié)構(gòu)。此外，放線菌能夠抵制惡劣的環(huán)境條件，耐高溫、酸堿，故在高溫條件下放線菌優(yōu)于真菌。放線菌在自然界中分布廣泛[28]。

因此，學(xué)者對(duì)放線菌的研究逐漸增多。Fennington等[29]采用化學(xué)和紫外照射等方法對(duì)Termomonospora curvata進(jìn)行混合誘變，篩選抗葡萄糖阻遏突變株。Wood等[30]研究了cAMP對(duì)Thermomonospora curata菌株纖維素酶生物合成過程中的作用。George等[31]從堆肥中分離篩選得到一株產(chǎn)纖維素酶嗜熱熱單胞菌屬放線菌。徐杰等[32]從土壤中分離得到一株具有降解纖維木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的酶的菌株，經(jīng)鑒定為灰略紅鏈霉素。宋波等(2005)[33]分離篩選得到耐堿的鏈霉菌。吳翔等(2007年)[34]在堆肥樣品中篩選出了一株產(chǎn)纖維素酶的高溫放線菌。

3.1.2 真菌

真菌分布廣泛，大多數(shù)在5～37℃下生長(zhǎng)良好。在高溫環(huán)境下的真菌對(duì)纖維素、半纖維素和木質(zhì)素有很強(qiáng)的分解作用，它們通過分泌胞外酶和菌絲穿插作用共同降解纖維素和木質(zhì)素。在堆肥過程中會(huì)有高溫真菌不斷地發(fā)生作用降解木質(zhì)纖維素。木霉、曲霉、青霉、輪枝孢霉、根霉等，能分解纖維素和半纖維素，并在有氧中溫下作用最強(qiáng)，綠色木霉能產(chǎn)生高活性的纖維素酶。洋蘑、鬼傘菌、茯苓、多孔菌、韌皮菌等白腐真菌能夠降解木質(zhì)素，白腐真菌中黃孢原毛平革菌研究最多。Denis等指出瘤胃厭氧真菌對(duì)纖維降解非常重要，其中研究的最好的是Neocallimastix sp[35]。潘亞杰等[36]指出白腐真菌是降解木質(zhì)素能力最強(qiáng)的微生物。

3.2 分解酶類

降解農(nóng)作物秸稈的酶類主要是纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素酶和木聚糖酶等。

纖維素酶目前分為3種類型，由外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶組成。纖維素酶廣泛存在。細(xì)菌、真菌、動(dòng)物體內(nèi)等都能產(chǎn)生纖維素酶。一般用于生產(chǎn)的纖維素酶來自于真菌，比較典型的有木霉屬、曲霉和青霉屬。半纖維素酶主要包括β-葡聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶，是分解半纖維素的酶的總稱。在飼料工業(yè)中應(yīng)用較多的是β-葡聚糖酶。

木質(zhì)素的降解酶系非常復(fù)雜，目前認(rèn)為最重要的木質(zhì)素降解酶有3種：木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶。除此之外，還有芳醇氧化酶、乙二醛氧化酶、葡萄糖氧化酶、酚氧化酶、過氧化氫酶等。木質(zhì)素的降解主要是真菌起作用。目前，研究較多的白腐菌有：黃孢原毛平革菌、煙管菌、變色栓菌、糙皮側(cè)耳等[37]。

4 提高農(nóng)作物秸稈利用率的生物學(xué)處理方法

4.1 青貯發(fā)酵

青貯發(fā)酵即自然發(fā)酵法，其原理是在厭氧條件下，植物體上的乳酸菌利用原料中的可溶性碳水化合物，發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，迅速降低pH值，從而殺滅或者抑制各種微生物的活動(dòng)，達(dá)到長(zhǎng)期保存青綠飼料的目的，同時(shí)可以提高飼料的適口性、消化率和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。青貯是保存青綠飼料的一種簡(jiǎn)單、可靠且經(jīng)濟(jì)的方法。而在農(nóng)作物秸稈中，只有玉米秸適合青貯。在生產(chǎn)中，青貯已廣泛應(yīng)用，而且現(xiàn)在青貯添加劑廣泛應(yīng)用，主要有營(yíng)養(yǎng)型添加劑、纖維素酶類添加劑、微生物制劑和抑制不良發(fā)酵的添加劑[38]。

青貯添加的微生物制劑主要是乳酸菌，一般作物秸稈含乳酸菌少，添加后可以加快發(fā)酵速度，抑制其他有害微生物，而且可以產(chǎn)生輕微的酸香味或水果味，增加適口性，提高消化率。常用的乳酸菌是同型發(fā)酵乳酸菌，例如植物乳酸桿菌、糞鏈球菌和片球菌，它們能迅速降低發(fā)酵底物的pH值，提高乳乙酸的生成比例，有效降低乙醇和氨態(tài)氮的產(chǎn)量。目前關(guān)于異型發(fā)酵乳酸菌的作用效果研究較少，且仍存在很多爭(zhēng)議。洪梅等[39]對(duì)分離自中國(guó)青貯窖中的一株發(fā)酵乳桿菌BLF01進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌BLF01屬于異型發(fā)酵，且可以作為一種青貯添加劑使用。除此，對(duì)青貯飼料飼喂效果的研究也很多，馬建齊等[40]用經(jīng)過青貯、黃貯處理的玉米秸稈飼喂肉牛，實(shí)驗(yàn)表明，青貯秸稈的飼喂效果明顯優(yōu)于黃貯料。秸稈黃貯料組每頭均日增重876.3 g，秸稈青貯料每頭均日增重1 128.36 g,秸稈青貯料組頭均日增重比黃貯料組提高128.76%,且組間差異顯著。

4.2 酶制劑處理

通常把具有酶特性的高效生物活性物質(zhì)與少量的載體混合制成酶制劑。酶制劑中一般含有纖維素分解酶、半纖維素分解酶、果膠酶，甚至還含有淀粉酶、蛋白酶、糖化酶等。這些酶能降解飼料中的纖維素、半纖維素，從而提高飼料的利用率，改善飼料的品質(zhì)[41]。

目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)酶制劑在秸稈類飼料青貯和黃貯中的應(yīng)用研究報(bào)道很多。Alvarez等(2009)[42]報(bào)道在奶山羊日糧中添加纖維素酶可以提高日糧干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)的消化率以及酸性洗滌纖維(ADF)、燕麥稈中性洗滌纖維(NDF)和ADF的瘤胃降解率。

4.3 復(fù)合菌處理

微生物處理主要是通過添加能夠降解木質(zhì)纖維素的微生物對(duì)秸稈進(jìn)行發(fā)酵，提高其適口性和消化率。對(duì)單一微生物處理秸稈的研究較少，復(fù)合微生物處理秸稈的研究效果顯著。張洋等（2010）[43]以秸稈為主要材料，采用生孢噬纖維菌、枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母對(duì)秸稈進(jìn)行發(fā)酵，經(jīng)發(fā)酵后，粗蛋白增加率和粗纖維降解率分別達(dá)到260.0%和28.89%。據(jù)徐堅(jiān)平等[44]研究表明綠色木霉和飼料酵母共生發(fā)酵秸稈，單細(xì)胞蛋白達(dá)30%，纖維素轉(zhuǎn)化率達(dá)51%。在使用微生物處理秸稈時(shí)，需要注意驗(yàn)證菌種間是否存在拮抗。史國(guó)翠[45]等利用康氏木霉與酵母混合發(fā)酵處理稻草秸稈，證明兩菌種間不僅無拮抗，而且酵母菌能促進(jìn)康氏木霉的生長(zhǎng)。

現(xiàn)在的研究表明，酶制劑與微生物制劑配合使用可以發(fā)揮更大的效果。金加明[46]指出，用綠色木霉產(chǎn)生的纖維素粗酶液和酵母菌混合處理的玉米秸稈飼喂小尾寒羊，試驗(yàn)組日增重比對(duì)照組高49.1 g。但是由于不同的酶和菌種的專一性，在它們聯(lián)用時(shí)，還應(yīng)考慮拮抗作用。王建兵等[47]聯(lián)用復(fù)合產(chǎn)乳酸菌、纖維素酶，結(jié)果表明效果優(yōu)于單純添加時(shí)，而且二者之間未產(chǎn)生拮抗作用。陳合等[48]利用黃孢原毛平革菌、外源纖維素酶、木聚糖酶處理玉米秸稈，最終使木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的降解率分別達(dá)到67.0%、60.4%、33.0%，秸稈還原糖的含量達(dá)到0.507 g。這些都表明菌酶共降解為玉米秸稈的生物利用提供了一種新方法。

5 結(jié)語

我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年產(chǎn)生大量的農(nóng)作物秸稈，而秸稈是一種很重要的可再生資源，所以，提高秸稈的利用效率將能使秸稈飼料具有巨大的利用潛力?，F(xiàn)今國(guó)內(nèi)外主要致力于農(nóng)作物秸稈的生物技術(shù)處理，但是生物發(fā)酵技術(shù)現(xiàn)在仍然存在一定的問題，所用的生物技術(shù)如酶解法與微生物發(fā)酵法等仍處于初級(jí)階段。目前，玉米秸稈生物發(fā)酵技術(shù)有較大發(fā)展，但是仍未找到玉米秸稈有效降解的途徑。

木質(zhì)素是秸稈飼料降解的限制性因素，木質(zhì)素與纖維素、半纖維素等的交聯(lián)影響了秸稈的降解效率，因此，尋找提高打開交聯(lián)鍵的有效方法十分重要。現(xiàn)今利用生物技術(shù)處理秸稈的應(yīng)用比較廣泛，但是秸稈降解率提高的原理仍有待于進(jìn)一步探討。