Akt基因?qū)∪饧?xì)胞發(fā)育的表觀調(diào)控

侯偉媛，張云生，牛華鋒，辛亞平

（1.西安市灞橋區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，陜西 西安710024；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子832000；3.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌712100；4.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100）

Akt是真核細(xì)胞中非常重要的絲／蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞生長、增殖、分化、代謝和細(xì)胞運動方面都有重要作用。在肌肉發(fā)育過程中，Akt可以促進成肌細(xì)胞增殖和分化。馬血清誘導(dǎo)C2C12分化模型中，Akt對維持肌管細(xì)胞存活，刺激肌管形成都有重要作用，Akt還能夠調(diào)控成熟肌管的數(shù)量和大小等。本文從Akt結(jié)構(gòu)與功能、Akt調(diào)控成肌細(xì)胞增殖與分化、Akt調(diào)控表觀修飾、肌細(xì)胞分化與組蛋白甲基化、Akt調(diào)控成肌細(xì)胞基因表達(dá)、問題與展望等方面論述了Akt基因?qū)∪饧?xì)胞發(fā)育的表觀調(diào)控，以期為畜禽肌肉發(fā)育和分化研究提供依據(jù)。

1 Akt結(jié)構(gòu)與功能

Akt／PKB是由480個氨基酸殘基組成，分子量約60 KD的絲／蘇氨酸激酶，與蛋白激酶A（PKA）和蛋白激酶C（PKC）分別具有65%和77%的序列同源性。哺乳動物有3種Akt的同源基因，Akt1／PKBα、Akt2／PKBβ和Akt3／PKBγ，三者基因序列同源性超過85%，并具有相似的蛋白結(jié)構(gòu)，即位于N端PH結(jié)構(gòu)域，中部催化結(jié)構(gòu)域，以及C端調(diào)節(jié)域三部分組成。Akt1在大部分組織中都有表達(dá)；Akt2主要在胰島素效應(yīng)組織，如骨骼肌、肝、腎和心臟中表達(dá)；Akt3則在睪丸和腦組織中高表達(dá)［1］。

磷酸化是Akt激活的主要方式，其活性調(diào)節(jié)主要依賴于磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）和磷酸肌醇依賴性激酶（PDK）信號通路。Akt具有兩個磷酸化調(diào)控修飾的活性位點（Thr308和Ser473），分別位于催化結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，該位點被磷酸化后Akt才能達(dá)到充分活化狀態(tài)。激活的Akt被轉(zhuǎn)位到胞質(zhì)或胞核，催化蛋白底物特定部位絲氨酸、蘇氨酸殘基的磷酸化，從而完成對胞內(nèi)外信號刺激的應(yīng)答［2］。

Akt1基因敲除小鼠，胚胎中后期和出生后3 d內(nèi)容易致死，出生時體重比野生型小鼠約低20%，存活個體則表現(xiàn)出明顯生長缺陷［3］。Akt2基因敲除小鼠，呈現(xiàn)典型Ⅱ型糖尿病表型，即高血糖、高胰島素血癥和葡萄糖耐受降低，胰島素抑制肝臟產(chǎn)糖的能力減弱［4］。Akt3基因敲除小鼠，腦體積變?。?］。小鼠Akt1和Akt2同時缺失，會導(dǎo)致嚴(yán)重發(fā)育不全，組織和器官發(fā)育缺陷，表明Akt1和Akt2在發(fā)育中具有重要作用［6］。

2 Akt活化

在胰島素、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNFα）等作用下，PI3K能夠介導(dǎo)PKB的激活。PI3K是由85KD的調(diào)節(jié)亞基和110KD的催化亞基組成的異源二聚體。調(diào)節(jié)亞基P85具有1個SH3結(jié)構(gòu)域；2個富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域和2個Src同源結(jié)構(gòu)域（Src homology domain 2，SH2）［7］。

當(dāng)細(xì)胞表面受體被活化后，PI3K在細(xì)胞膜上催化產(chǎn)生3，4二磷酸磷脂酰肌醇（PI-3，4-P2）和3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇（PI-3，4，5-P3）。二磷酸磷脂酰肌醇能夠催化Akt產(chǎn)生同源二聚體，使部分Akt磷酸化。同時，在3、4、5三磷酸磷脂酰肌醇和p H結(jié)構(gòu)域共同作用下，Akt能夠與細(xì)胞膜結(jié)合，使更多的二聚體Akt被磷酸化，活化的Akt從細(xì)胞膜上解離下來［8］，并向細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核特定區(qū)域轉(zhuǎn)運，與相應(yīng)部位的底物蛋白相互作用，將底物蛋白特異位點的絲、蘇氨酸磷酸化，從而使細(xì)胞信號繼續(xù)傳遞，并產(chǎn)生特定的細(xì)胞響應(yīng)。

3 Akt調(diào)控成肌細(xì)胞增殖與分化

體外培養(yǎng)的成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化時，Akt2表達(dá)升高，而Akt1保持不變。Akt1和Akt2在維持成肌細(xì)胞存活、再生和肥大方面，各自具體功能還不清楚。

3.1 Akt功能與成肌細(xì)胞

在成肌細(xì)胞和肌管細(xì)胞中，Akt1和Akt2都有表達(dá)，在分化細(xì)胞中，只有Akt2存在于核中［9］。當(dāng)成肌細(xì)胞分化時，異源表達(dá)Akt1可有效抑制MCK轉(zhuǎn)錄，而Myogenin基因轉(zhuǎn)錄不受影響。異源表達(dá)Akt2會增加MCK和Myogenin基因轉(zhuǎn)錄，表明Akt2能夠促進成肌細(xì)胞分化。不管是野生型或激活型，Akt2促進肌肉特異基因的轉(zhuǎn)錄效率都要高于Akt1，向細(xì)胞內(nèi)注入Akt2的抗體，能夠抑制肌細(xì)胞分化，注入Akt1的抗體則沒有此作用［9］。

siRNA分別干擾Akt1和Akt2，只有當(dāng)Akt2被干擾時，將會阻止成肌細(xì)胞退出細(xì)胞周期和抑制分化。Akt2過表達(dá)后，將增加成肌細(xì)胞分化為肌管的比例，MyoD過表達(dá)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，需要Akt2參與。注入Akt1抗體，可阻止肌細(xì)胞或非肌細(xì)胞正常細(xì)胞周期進程，而注入Akt2抗體并沒有同樣的效果。沉默Akt1后，引起細(xì)胞周期蛋白A表達(dá)降低，阻止細(xì)胞進入S期；相反Akt2缺失后，會阻止細(xì)胞退出細(xì)胞周期，細(xì)胞周期蛋白A表達(dá)水平不變。過表達(dá)Akt2，細(xì)胞周期蛋白A表達(dá)會減少，阻止細(xì)胞從M期到G1期，并伴隨核內(nèi)p21增加［10］。

雖然很多研究表明，Akt2對成肌細(xì)胞分化有重要作用，但也有報道稱Akt1能夠調(diào)控肌細(xì)胞分化，而Akt2則不能。表達(dá)結(jié)構(gòu)域失活的Akt1對細(xì)胞存活和增殖沒有影響，但是可以通過沉默MyoD轉(zhuǎn)錄，阻止MyoD誘導(dǎo)的肌細(xì)胞分化，而干擾Akt2則不影響細(xì)胞的存活、增殖以及MyoD的轉(zhuǎn)錄［11］。

3.2 Akt功能與肌細(xì)胞代謝調(diào)控

在調(diào)控代謝方面，Akt1和Akt2也具有不同作用，IRS-1／Akt2對成肌細(xì)胞分化和葡萄糖代謝是必需的；而IRS-2／Akt1通路在脂代謝方面有重要作用。表達(dá)激活型的Akt1或Akt2，會導(dǎo)致肌纖維肥大、p70S6激酶磷酸化和糖原增加60%。Akt1能夠增加糖原合成酶（GSK）磷酸化。Akt2能夠增加葡萄糖吸收，沉默Akt2會引起糖原貯存和葡萄糖吸收減少，說明Akt2對葡萄糖轉(zhuǎn)運有重要作用［12］。

4 Akt調(diào)控表觀修飾

4.1 Akt調(diào)控DNA甲基轉(zhuǎn)移酶

對人17種細(xì)胞系和27份膀胱癌組織檢測發(fā)現(xiàn)，p-Akt磷酸化修飾與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（Dnmt1）蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)。進一步分析表明，Akt在轉(zhuǎn)錄水平對Dnmt1無調(diào)控作用，但可以增加Dnmt1的蛋白穩(wěn)定性，從而上調(diào)Dnmt1蛋白水平，維持DNA甲基化和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。IL-6處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，Akt能夠磷酸化Dnmt1核定位信號肽，激活Dnmt1從胞質(zhì)向核內(nèi)轉(zhuǎn)運［13］。

4.2 Akt調(diào)控組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶

IGF-1／PI3K／Akt信號通路能夠在染色質(zhì)水平調(diào)控成肌細(xì)胞分化。添加PI3K特異性抑制劑，肌肉分化特異基因，如MCK和Myogenin，啟動子區(qū)H3K27me3修飾水平升高。Akt能夠磷酸化H3K27甲基轉(zhuǎn)移酶Ezh2第21位絲氨酸殘基，降低Ezh2與組蛋白H3結(jié)合能力，減弱催化甲基化生成的能力，H3K27me3水平減少。

酵母雙雜試驗發(fā)現(xiàn)，組蛋白H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1與Akt1有直接相互作用，但Akt并不磷酸化SETDB1。NGF處理PC細(xì)胞12 h后，染色質(zhì)H3K9me3修飾水平下降，H3K9乙?；缴撸诉^程中表觀修飾變化與NGF誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄活性具有一致性［14］。

5 肌細(xì)胞分化與組蛋白甲基化

在細(xì)胞發(fā)育和分化過程中，組蛋白甲基化修飾能夠響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外信號刺激，發(fā)生動態(tài)改變，參與基因表達(dá)調(diào)控。H3K27甲基化做為重要的組蛋白修飾形式，能夠調(diào)控肌肉分化特異基因表達(dá)，使肌細(xì)胞分化以及肌管形成順利進行。

ES細(xì)胞全基因組水平組蛋白修飾分析表明，部分基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)同時存在H3K4me3和H3K27me3雙重修飾，基因呈低水平表達(dá)，這種修飾方式多位于重要轉(zhuǎn)錄因子和信號通路基因的啟動子區(qū)，在終未分化的細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有雙重修飾現(xiàn)象。當(dāng)Ca2＋誘導(dǎo)分化時，去甲基化酶Jmjd3與表皮細(xì)胞分化相關(guān)基因啟動子區(qū)結(jié)合增加，H3K27me3和PcG被去除。表皮組織中失活Jmjd3，會阻止分化；激活Jmjd3，將誘導(dǎo)分化，表明Jmjd3能夠調(diào)控H3K27甲基化水平，促進哺乳動物表皮分化［15］。

成肌細(xì)胞分化時，抑制型的H3K27甲基化修飾將首先被去除，然后再募集轉(zhuǎn)錄激活因子到基因組特定區(qū)域，激活肌肉分化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，促進肌肉特異基因表達(dá)和肌細(xì)胞分化。H3K27甲基轉(zhuǎn)移酶Ezh2能夠調(diào)控肌肉特異性基因表達(dá)，使肌肉發(fā)育和分化正常進行。當(dāng)成肌細(xì)胞被誘導(dǎo)分化后，Ezh2表達(dá)下調(diào)，肌肉特異基因啟動子區(qū)H3K27甲基化水平降低，激活分化特異基因表達(dá)，促進成肌細(xì)胞分化順利進行，而過表達(dá)Ezh2將抑制肌肉分化，表明Ezh2能夠通過甲基轉(zhuǎn)移酶活性抑制肌肉分化［16］。H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶Suv39h1能夠抑制肌肉特異基因表達(dá)，使肌細(xì)胞保持增殖狀態(tài)，過表達(dá)Suv39h1，能抑制依賴MyoD轉(zhuǎn)錄的肌肉特異基因的表達(dá)。此作用需Suv39h1結(jié)合MyoD，維持Myogenin啟動子區(qū)H3K9甲基化修飾。Suv39h1和MyoD是否結(jié)合于肌肉特異抑制基因的啟動子區(qū)，是肌細(xì)胞最終會發(fā)生增殖或分化的決定因素［17］。

6 Akt調(diào)控成肌細(xì)胞基因表達(dá)

NF-κB不僅能夠調(diào)節(jié)先天免疫和細(xì)胞存活，而且在皮膚、肌肉分化過程中也具有重要作用。在成肌細(xì)胞分化過程中，p38和NF-κB可以誘導(dǎo)IL-6表達(dá)。干擾IL-6會減弱成肌細(xì)胞分化，而過表達(dá)IL-6會促進分化作用，添加IL-6后，可以補救由于NF-κB抑制所引起的肌肉分化抑制現(xiàn)象。在增殖情況下，成肌細(xì)胞失去NF-κB的作用，將會檢測到肌纖維基因的表達(dá)，說明肌細(xì)胞分化后期NF-κB對肌肉特異基因表達(dá)有負(fù)調(diào)節(jié)作用［11］。盡管預(yù)測幾種肌纖維基因的啟動子區(qū)含有NF-κB結(jié)合位點，研究表明NF-κB抑制基因表達(dá)，并不是直接與DNA結(jié)合，NF-κB可以在轉(zhuǎn)錄水平上增加YY1基因表達(dá)，從而抑制肌肉特異基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控成肌細(xì)胞分化［18］。

7 小 結(jié)

Akt是細(xì)胞內(nèi)重要的絲／蘇氨酸蛋白激酶，具有多種作用底物，能夠在基因表達(dá)和表觀修飾等多個層次上參與細(xì)胞功能調(diào)控。在肌細(xì)胞分化過程中，表觀修飾如DNA甲基化、組蛋修飾和染色質(zhì)重塑，都發(fā)生了很明顯的變化，并受到精確調(diào)控。成肌細(xì)胞是研究肌肉發(fā)育、分化最重要的細(xì)胞模型，多種肌肉特異性調(diào)控基因被發(fā)現(xiàn)和鑒定，表觀調(diào)控將成為研究肌肉發(fā)育和分化的重要內(nèi)容。

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