刺參酸性黏多糖對人肝癌Hep G2細胞線粒體膜電位及鈣離子濃度的影響

陳沉,金巖,宋揚

(青島大學醫(yī)學院營養(yǎng)研究所,山東青島 266021)

·腫瘤學研究·

刺參酸性黏多糖對人肝癌Hep G2細胞線粒體膜電位及鈣離子濃度的影響

陳沉,金巖,宋揚

(青島大學醫(yī)學院營養(yǎng)研究所,山東青島 266021)

目的觀察刺參酸性黏多糖(SJAMP)體外誘導(dǎo)人肝癌細胞Hep G2凋亡的情況,探討SJAMP對HepG2細胞線粒體凋亡途徑相關(guān)膜電位作用機制。方法體外培養(yǎng)人肝癌細胞HepG2,用不同濃度的SJAMP (0.25、1.00、4.00 mg/L)對其進行干預(yù),應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞線粒體膜電位改變,Fura-2熒光顯微鏡檢測細胞鈣離子濃度改變。在相同條件下干預(yù)人正常肝細胞(張氏細胞)以觀察其對正常細胞的影響。結(jié)果隨著SJAMP劑量的增加,Hep G2細胞內(nèi)鈣離子濃度及線粒體膜電位均降低,各干預(yù)組與空白對照組比較、各干預(yù)組間比較差異均有顯著性(F＝183.36、264.24,q＝3.26～35.67,P＜0.05);而張氏細胞各干預(yù)組鈣離子濃度及線粒體膜電位(除0.25 mg/L SJAMP作用組線粒體膜電位高于其他組外)差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結(jié)論SJAMP可能通過降低細胞內(nèi)鈣離子濃度和細胞線粒體膜電位,誘導(dǎo)線粒體通透性的改變,啟動細胞凋亡途徑。

肝腫瘤;HepG2細胞;刺參屬(動物);多糖;細胞凋亡

原發(fā)性肝癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,具有發(fā)病率高、發(fā)現(xiàn)晚、惡化率高等特征,嚴重威脅人類生命健康。由于現(xiàn)有抗肝腫瘤化學藥物副作用較大,越來越多的研究人員將抗腫瘤研究轉(zhuǎn)向自然環(huán)境中高效低副作用的多糖類物質(zhì)[1]。刺參酸性黏多糖(SJAMP)是刺參體壁真皮結(jié)締組織中的一種生物活性結(jié)締組織多糖,眾多研究顯示,其具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及促細胞生長等多種活性作用[2-4]。線粒體膜電位的改變是細胞線粒體凋亡途徑的重要起始階段,由于線粒體膜電位改變引起線粒體通透性變化,進一步釋放出細胞色素C等促凋亡因子,促使細胞凋亡。本實驗通過檢測SJAMP對Hep G2細胞線粒體膜電位相關(guān)指標的影響,為進一步探討SJAMP促細胞凋亡作用提供初步理論依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞株HepG2細胞及人正常肝組織細胞(人張氏肝細胞),由中國科學院上海生命科學院細胞研究所提供,使用含體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM、1640培養(yǎng)液,在37℃、體積分數(shù)0.05 CO2孵箱中培養(yǎng)[5]。

1.2 熒光顯微鏡檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度

取對數(shù)生長期的Hep G2細胞以及人張氏肝細胞,以1×109/L的密度接種于6孔培養(yǎng)板中,細胞貼壁后,棄上清,各組分別加入終濃度為0.25、1.00、4.00 mg/L的SJAMP,以不加SJAMP者作為空白對照組,孵育24 h后進行細胞內(nèi)鈣離子檢測。將含有2μmol/L Fura-2 AM的適當溶液和細胞一起在37℃條件下孵育30 min,完成熒光探針的裝載。PBS洗滌2次,嚴格按照試劑盒說明書操作,綠色熒光代表被結(jié)合的鈣離子。用奧林巴斯公司提供熒光顯微鏡觀察,激發(fā)波長340 nm,發(fā)射波長510 nm,采用Imagepro-plus軟件進行熒光分析,以Integral Optical Density(IOD)值表示鈣離子濃度。

1.3 流式細胞儀檢測線粒體膜電位

取對數(shù)生長期的細胞,以1×109/L的密度接種于6孔培養(yǎng)板中,細胞貼壁后,棄上清,各組分別加入濃度為0.25、1.00、4.00 mg/L的SJAMP,孵育24 h后用2.5 g/L胰酶收集所有細胞,再將細胞吹打均勻,制成單細胞懸液,用PBS調(diào)整細胞密度至1×1012/L,加入染色劑JC-1(終濃度為5 mg/L), 37℃避光20 min,棄上清,PBS洗2次,用PBS溶液重懸沉淀,流式細胞儀檢測JC-1單體(激發(fā)波長490 nm,發(fā)射波長530 nm)和JC-1聚合物(激發(fā)波長525 nm,發(fā)射波長590 nm),用熒光強度值表示線粒體膜電位[6]。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度SJAMP對細胞內(nèi)鈣離子濃度影響

SJAMP作用與非作用的HepG2細胞內(nèi)都有鈣離子的存在,與Fura-2熒光染料結(jié)合后顯藍綠色熒光。隨著SJAMP濃度的增加,HepG2細胞內(nèi)鈣離子濃度逐漸下降,各劑量組與空白對照組、各劑量組之間比較,差異均有統(tǒng)計學意義(F＝183.36,q＝6.44～27.01,P＜0.05);而人張氏肝細胞內(nèi)的鈣離子濃度沒有明顯改變(P＞0.05)。見表1。

2.2 不同濃度SJAMP對線粒體膜電位的影響

隨著SJAMP濃度的增加,Hep G2細胞線粒體膜電位逐漸下降,各劑量組與空白對照組、各劑量組之間比較,差異均有顯著性(F＝264.24,q＝3.26～35.67,P＜0.05);而人張氏肝細胞線粒體膜電位除低劑量組(0.25 mg/L)高于其他組外,其他各組比較差異無顯著性(P＞0.05)。見圖1、2,表2。

表1 不同濃度SJAMP對HepG2及人張氏肝細胞鈣離子濃度的影響(n＝3,IOD±s)

SJAMP濃度(ρ/mg·L－1)___Hep G2細胞_____________________人張氏肝細胞0 115.33±5.13 62.35±2.31 0.25 81.67±3.76 79.42±3.01 1.00 64.33±3.51 75.22±2.08 ____________4.00_______________________________________________ 44.00±2.64 72.33±3.51

表2 不同濃度SJAMP對HepG2細胞及人張氏肝細胞線粒體膜電位的影響(n＝3±s)_______________________

SJAMP濃度(ρ/mg·L－1)___Hep G2細胞_____________________人張氏肝細胞0 62.82±4.64 19.92±0.62 0.25 22.11±2.13 21.36±0.84 1.00 12.63±1.43 19.48±0.18 ___________4.00_____________________________________________ 7.89±0.55 19.75±0.33

3 討 論

凋亡或稱程序性細胞死亡,是一種受基因調(diào)節(jié)的自主控制過程,在生物個體發(fā)育和生存中起著非常重要的作用。已有研究表明,線粒體是細胞凋亡調(diào)控的活動中心,Ca2＋-cytc-caspase-3信號介導(dǎo)的線粒體凋亡通路是公認的經(jīng)典凋亡途徑[8]。線粒體外膜通透性增加及膜間凋亡分子釋放,是決定凋亡起始的關(guān)鍵步驟[9]。細胞鈣離子濃度降低引起跨膜電位下降,將會引起線粒體膜通透性改變,導(dǎo)致促凋亡物質(zhì)的釋放及Caspase家族激活,促使細胞凋亡。多數(shù)細胞凋亡時跨膜電位均會下降,這種改變發(fā)生于細胞凋亡形態(tài)學改變之前,提示跨膜電位的改變?yōu)榧毎蛲鲞^程中的早期階段[10]。

SJAMP具有抗腫瘤活性,能夠抑制惡性腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡,但是其抗腫瘤的分子機制尚處研究階段。我們前期研究顯示,SJAMP作用于Hela細胞后,各干預(yù)組的細胞周期蛋白PCNA表達量均下調(diào),且隨著SJAMP濃度的增大及作用時間的延長,各干預(yù)組中caspase-3及caspase-9的表達均有增加趨勢,說明SJAMP能通過抑制細胞增殖及促進細胞凋亡兩種方式抗腫瘤[11-12]。

本研究結(jié)果顯示,隨著SJAMP劑量的增加,肝癌細胞株Hep G2細胞內(nèi)的鈣離子濃度及線粒體膜電位逐漸降低,而人張氏肝細胞株并沒有明顯改變,提示SJAMP作用于Hep G2細胞后,可能會引起細胞鈣離子濃度的降低及線粒體膜電位的下降,使線粒體內(nèi)外通透性改變,從而啟動細胞凋亡途徑。本文結(jié)果與張延坤等[13]和安超等[14]研究結(jié)果相似。

人張氏肝細胞是人永生化的肝細胞株,具有人類正常肝細胞的各種特征,本研究使用張氏肝細胞作為正常肝細胞對照組,以探討SJAMP對正常肝細胞的影響。結(jié)果顯示,在與Hep G2細胞相同劑量SJAMP作用下,人張氏肝細胞各干預(yù)組線粒體膜電位并沒有表現(xiàn)出類似于HepG2細胞干預(yù)組的明顯改變,除低劑量組(0.25 mg/L)線粒體膜電位高于其他組外,其他各組比較差異均無顯著性,說明SJAMP對人張氏肝細胞的線粒體膜電位及細胞鈣離子濃度無影響。對于低劑量(0.25 mg/L)SJAMP作用組線粒體膜電位高于其他組,其原因可能為:①線粒體膜電位改變時,電子傳遞鏈會漏出少量的電子,這類電子能直接和氧形成超氧自由基進一步衍生為活性氧(ROS),而ROS能夠引發(fā)細胞氧化應(yīng)激,引起細胞損傷,導(dǎo)致線粒體膜電位的紊亂[15];②線粒體膜電位的改變迅速而敏感,人張氏肝細胞對于SJAMP的敏感濃度范圍可能過小。陳尉華等[15]的研究結(jié)果顯示,藥物濃度過低對人張氏肝細胞的干預(yù)作用不明顯,而過高會漸漸出現(xiàn)抑制作用。故本研究低劑量(0.25 mg/L)SJAMP干預(yù)組人張氏肝細胞線粒體膜電位的變化,可能是由于誘發(fā)了細胞氧化應(yīng)激反應(yīng),或其濃度恰好處于人張氏肝細胞的敏感濃度范圍之內(nèi)而產(chǎn)生的,其發(fā)生的具體原因亟待進一步研究。

總之,SJAMP能夠誘導(dǎo)肝癌細胞株HepG2細胞內(nèi)鈣離子濃度降低及線粒體膜電位下降,說明其具有誘導(dǎo)腫瘤細胞線粒體起始凋亡途徑的作用。

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(本文編輯 黃建鄉(xiāng))

EFFECTOFJAPONICUSACIDMUCOPOLYSACCHARIDEONMITOCHONDRIALMEMBRANEPOTENTIALANDCALCIUM IONCONCENTRATIONINHUMANLIVERCANCERHepG2CELLS

CHEN Chen,JIN Yan,SONG Yang (Department of Nutrition,Qingdao University Medical College,Qingdao 266021,China)

ObjectiveTo study the HepG2 cell apoptosis induced by Stichopus japonicus acidic mucopolysaccharide (SJAMP)in vitro,and explore the mechanism of changes of its correlated mitochondrial membrane potential.MethodsHepG2 cells cultured in vitro were exposed to different concentrations of SJAMP(0.25,1.00,4.00 mg/L).Flow cytometry was used to detect the changes of mitochondrial membrane potential,and a fluorescence microscope to measure the calcium ion concentration in the cells.Chang’s liver cells were interfered under the same conditions to observe their influence on normal cells.ResultsWith the increasing of SJAMP dose,the intracellular calcium ion concentration and membrane potential decreased,a comparison between each intervention group and blank control group,as well as between each intervention group,the differences being significant(F＝183.36,264.24;q＝3.26－35.67;P＜0.05).In Chang’s liver cells,the differences of calcium ion concentrations and membrane potential between each intervention group were not significant－except 0.25 mg/L SJAMP action group(P＞0.05).ConclusionSJAMP is likely through decreasing intracellular calcium ion concentration and cell mitochondrial membrane potential,inducing changes of permeability of mitochondrial membrane and initiating the path of apoptosis.

liver neoplasms;HepG2 cells;stichopus;mucopolysaccharide;cell apoptosis

R151.3

A

1008-0341(2013)04-0283-04

10.11712/qlyx201304001

2013-01-13;

2013-05-21

國家自然基金資助項目(002-002395)

陳沉(1987-),男,碩士研究生。

宋揚(1968-),男,博士,教授,碩士生導(dǎo)師。