大鼠壓瘡缺血再灌注模型構建及相關指標觀察

黃倩,高玉芳,魏麗麗,陸連芳,張宏巖,馬曉燕

(1 青島大學醫(yī)學院護理學院,山東青島 266021; 2 青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

大鼠壓瘡缺血再灌注模型構建及相關指標觀察

黃倩1,高玉芳2,魏麗麗2,陸連芳2,張宏巖2,馬曉燕1

(1 青島大學醫(yī)學院護理學院,山東青島 266021; 2 青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

目的構建大鼠不同分期的壓瘡缺血再灌注動物模型,并分析其缺血再灌注損傷相關指標的含量變化。方法將64只健康雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、控制對照組、Ⅰ期壓瘡組、Ⅱ期壓瘡組、Ⅲ期壓瘡組、Ⅳ期壓瘡組、可疑深部組織損傷組、難以分期壓瘡組,每組8只。采用臀肌下埋置鐵片外加磁鐵加壓的方法構建大鼠壓瘡缺血再灌注模型,檢測并比較各組超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)、C反應蛋白(CRP)、局部滲出液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量。結果大鼠各期壓瘡缺血再灌注動物模型均構建成功。與正常對照組比較,各期壓瘡組SOD活性明顯下降,MDA、CRP含量明顯增加,差異有顯著性(F＝55.54～156.90,q＝5.026～38.744, P＜0.05);各期壓瘡組之間比較,差異亦有顯著性(q＝4.086～33.642,P＜0.05)。局部滲出液中TNF-α含量Ⅲ期壓瘡組低于Ⅳ期壓瘡組,差異有顯著性(t＝5.82,P＜0.05)。結論構建6期壓瘡動物模型并明確各期壓瘡的生理變化,可為壓瘡相關實驗研究和臨床治療提供理論依據(jù)。

壓力性潰瘍;缺血;再灌注損傷;大鼠,Sprague-Dawley

壓瘡一直是長期臥床病人難以解決的一大皮膚難題。在壓瘡治療方面,臨床觀察研究居多,基礎研究相對較少。國內(nèi)外關于早期壓瘡動物模型制備和形成機制的研究較多,但大多是根據(jù)1989年4期壓瘡分期標準或更早的壓瘡分期標準而構建出的Ⅰ期、Ⅱ期早期壓瘡動物模型。本實驗根據(jù)2007年美國國家壓瘡指導專家組(NPUAP)新公布的6期壓瘡分期標準[1],在WASSERMANN等[2]造模方法的基礎上,制備6期壓瘡動物模型,并檢測各期壓瘡再灌注損傷相關指標的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠64只,月齡12～14周,體質(zhì)量(220±20)g,由我院附屬醫(yī)院動物實驗中心提供。單籠飼養(yǎng),自由進食、飲水,室內(nèi)溫度維持在22～30℃,相對濕度50%～70%,明暗周期12 h。

1.1.2 試劑與材料 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、C-反應蛋白(CRP)及腫瘤壞死因子α (TNF-α)ELASA檢測試劑盒,均由南京建成生物工程研究所提供。圓形鐵片(直徑為12 mm,厚度1 mm,質(zhì)量1 g)和圓形磁鐵(直徑為12 mm,厚度2.5 mm,質(zhì)量2 g),均購自青島青磁材料有限責任公司。磁鐵的磁通量密度為為0.16 T[3]。鐵片在植入皮膚前均經(jīng)高壓蒸汽滅菌處理。

1.1.3 主要儀器 可見光分光光度計,37℃恒溫氣浴箱,臺式離心機,可調(diào)到95℃左右的恒溫水浴箱,標準規(guī)格酶標儀,精密移液器,一次性吸頭,試管等。

1.2 動物分組和模型建立

將64只大鼠隨機分為正常對照組、控制對照組、Ⅰ期壓瘡組、Ⅱ期壓瘡組、Ⅲ期壓瘡組、Ⅳ期壓瘡組、可疑深部組織損傷組、難以分期壓瘡組,每組8只。大鼠適應性生活2周后,正常對照組不做任何處理,繼續(xù)給予飼料正常喂養(yǎng)。余下的7組大鼠禁食12 h,自由飲水,用100 g/L水合氯醛(350 mg/ kg)腹腔注射麻醉后,臀部剪毛、備皮4 cm×5 cm大小,再用聚維酮碘消毒液對備皮區(qū)進行消毒;在大鼠臀部做一深至肌肉層的切口,長約2 cm,鈍性分離肌肉組織;將鐵片植入大鼠臀部肌肉下,縫合肌肉組織和筋膜,然后連續(xù)縫合皮膚層,再用碘附消毒以防止感染?？刂茖φ战M大鼠只給予鐵片植入;剩余的6組大鼠術后24 h在植入鐵片的皮膚外放置磁鐵,從而對皮膚及肌肉組織產(chǎn)生壓力,造成局部組織缺血,每次缺血2 h后將外源磁鐵取下30 min,讓局部血流恢復,此操作為1個循環(huán)。

1.3 觀察指標和方法

1.3.1 血清CRP和TNF-α檢測 采用斷尾取血法采集大鼠尾靜脈血1 m L(取血前禁食12 h),收集創(chuàng)面局部滲出液,室溫放置1 h后將標本置－20℃冰箱凍存待測。待全部標本收集完畢后,3 000 r/ min離心15 min分離血清,分別應用大鼠CRP和TNF-α的ELASA試劑盒檢測CRP含量和TNF-α含量,嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3.2 血清SOD活性和MDA含量測定 將各組大鼠麻醉后采集腹主動脈血5 m L,放入不含抗凝劑的試管中,以3 600 r/min,4℃離心10 min,取血清。用分光光度計根據(jù)SOD和MDA試劑盒操作步驟檢測血清中SOD活性和MDA含量。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 肉眼觀察

本文64只大鼠全部進入結果分析,數(shù)據(jù)無缺失。根據(jù)2007年NPUAP公布的6期壓瘡分期標準[1],1個循環(huán)后大鼠皮膚雖完整但出現(xiàn)了壓之不褪色的紅斑,Ⅰ期壓瘡組造模成功;5個循環(huán)后大鼠受壓處皮膚出現(xiàn)粉紅色的破損,Ⅱ期壓瘡組造模成功;25個循環(huán)后大鼠受壓處全層傷口,失去全層皮膚組織,除了骨、肌腱或肌肉尚未暴露外,可見皮下組織,Ⅲ期壓瘡組造模成功;35個循環(huán)后大鼠受壓處全層傷口,失去全層皮膚組織,損傷深達肌肉組織,露出鐵片,Ⅳ期壓瘡組造模成功;15或20個循環(huán)后大鼠受壓處皮膚呈紫色,出現(xiàn)瘀傷但局部皮膚完整,在膚色較深部位的組織損傷可能難以發(fā)現(xiàn),可疑深部組織損傷組造模成功;30個循環(huán)后大鼠受壓處全層傷口,失去全層皮膚組織,潰瘍被腐痂或痂皮覆蓋,只有腐痂或痂皮充分去除,才能確定真正的分期,難以分期壓瘡組造模成功。

2.2 各組大鼠CRP和TNF-α含量比較

各期壓瘡組與正常對照組比較、各期壓瘡組之間比較,血清CRP含量差異均有統(tǒng)計學意義(F＝132.61,q＝5.688～38.992,P＜0.01);控制對照組與正常對照組比較,CRP含量差異無顯著性(P＞0.05)。Ⅳ期壓瘡組局部滲出液中TNF-α含量明顯高于Ⅲ期壓瘡組,差異有統(tǒng)計學意義(t＝5.82,P＜0.05)。見表1。

2.3 各組大鼠血清SOD活性和MDA含量比較

各期壓瘡組SOD活性、MDA含量比較,差異有顯著性(F＝55.54、156.90,q＝3.330～38.744, P＜0.05);控制對照組與正常對照組SOD活性和MDA含量比較,差異無顯著性(P＞0.05)。見表1。

2.4 各期壓瘡組各指標相關性

將6期壓瘡組(共48只)CRP、SOD、MDA值進行相關性分析,SOD與CRP、MDA呈顯著負相關(r＝－0.940、－0.938,P＜0.01),CRP與MDA呈顯著正相關(r＝0.970,P＜0.01)。Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡局部滲出液中TNF-α與血清CRP、MDA呈正相關(r＝0.680、0.671,P＜0.05),與SOD呈負相關(r＝－0.678,P＜0.05)。

3 討 論

3.1 壓瘡缺血再灌注損傷模型構建

壓瘡是由多因素共同作用形成的,其發(fā)生機制也存在著多種不同的假說,其中缺血再灌注損傷學說是當今國內(nèi)外研究的熱點之一[4]。本實驗借鑒了WASSERMANN等[2]的裸鼠4期壓瘡模型的實驗方法,通過改變?nèi)毖俟嘧⒌难h(huán)數(shù)成功構建了大鼠6期壓瘡缺血再灌注模型,隨著缺血再灌注循環(huán)數(shù)的增加,即缺血再灌注損傷時間的增加,其皮膚損傷程度逐漸加重。該方法最突出的優(yōu)勢是整個受壓和解壓過程中實驗大鼠均處于非麻醉狀態(tài),可以排除麻醉因素對一些生化指標的影響;但另一方面,該模型需提前植入鐵片,額外增加了皮膚和肌肉組織的損傷,有可能影響后期實驗觀察。本實驗中所有用到的鐵片在移植前均經(jīng)高壓滅菌,嚴格執(zhí)行無菌操作原則,將其對結果的影響降到最小。為確保數(shù)據(jù)的準確性,本研究設了控制對照組(只植入鐵片,未給予缺血再灌注循環(huán)操作),結果顯示控制對照組與正常對照組之間各指標結果差異無顯著性,說明采用該方法造模不會影響結果。

表1 各組各指標檢測結果比較(n＝8,±s)

_____組__別__________________CRP(ρ/μg·L－1)_______TNF-α(ρ/ng·L－1)SOD(z/k U·L－1)MDA(c/μmol·L－1)正常對照組228.99±4.63－187.19±4.97 7.61±0.55控制對照組230.88±4.48－184.11±6.83 8.01±0.46Ⅰ期壓瘡組260.80±13.22－173.77±7.78 8.80±0.57Ⅱ期壓瘡組284.84±12.69－155.75±7.07 13.68±0.72Ⅲ期壓瘡組363.74±16.46 21.42±1.02 134.57±7.34 27.97±0.87Ⅳ期壓瘡組448.94±22.50 24.83±1.31 115.56±6.69 36.31±1.11可疑深部組織損傷組327.34±20.65－144.84±11.35 21.83±2.00 ___難以分期壓瘡組_____________403.12±20.51______________________________________________________________________________________ ____________－125.68±6.85 31.66±5.27

3.2 壓瘡缺血再灌注損傷模型各指標變化及意義

3.2.1 CRP、TNF-α含量變化及意義 近年來,再灌注損傷與炎癥之間的關系備受關注,但關于炎癥與皮膚缺血再灌注損傷關系的研究較少。CRP和TNF-α都是反映體內(nèi)炎癥水平的重要指標,但尚未有研究證實CRP和TNF-α與各期壓瘡發(fā)生發(fā)展的關系。本實驗結果顯示,隨著缺血再灌注循環(huán)數(shù)的增加,壓瘡嚴重程度越來越重,各期壓瘡組CRP含量也逐漸增加,差異有顯著性;在造模過程中只有Ⅲ期和Ⅳ期壓瘡組出現(xiàn)了滲液,Ⅳ期壓瘡組TNF-α高于Ⅲ期壓瘡組,差異有顯著性。說明炎癥反應并非僅僅發(fā)生在壓瘡早期,它是貫穿在整個壓瘡發(fā)生、發(fā)展過程中的。伴隨著缺血再灌注循環(huán)數(shù)的增加,體內(nèi)炎性反應逐漸加重,皮膚損傷程度也逐漸增加。本文相關分析結果顯示,Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡局部滲出液中TNF-α與血清CRP之間存在著正相關,說明在炎癥反應啟動后,兩種炎性因子可能會互相激活,從而增強炎性損傷。因此,炎性因子的作用是缺血再灌注損傷發(fā)生的重要機制之一。這與張純瑜等[5]的結論相一致。提示在今后的各期壓瘡治療過程中,抗炎治療均應作為不可忽視的措施之一。

3.2.2 SOD活性和MDA含量變化及意義 有作者對不同壓迫緩解時間下SOD活性和MDA含量的變化及意義進行了研究,結果顯示,若在短時間內(nèi)局部重復受壓,則可能加大壓瘡發(fā)生的危險性[6-7]。本文結果顯示,隨著缺血再灌注循環(huán)數(shù)的增加,各期壓瘡組SOD活性逐漸降低,MDA含量逐漸增加,差異均有統(tǒng)計學意義,且SOD和MDA之間存在著負相關。說明當皮膚發(fā)生缺血再灌注損傷時,體內(nèi)的自由基生成增多可引發(fā)組織氧化應激反應,導致MDA含量增加;自由基還可使SOD失去活性,失活的SOD不能有效地清除自由基,MDA含量也因而進一步升高,這樣就形成了一個惡性循環(huán)。這與郭樹忠等[8]的結論相一致。在壓瘡形成過程中,氧自由基起著重要的作用,SOD、MDA聯(lián)合檢測可有效判斷壓瘡的嚴重程度。

本研究在相同的實驗操作人員、實驗條件下,采用相同的實驗方法,根據(jù)同一壓瘡分期標準構建出的6期壓瘡動物模型更具客觀性,可為各期壓瘡研究提供基礎。

[1]BLACK J,BAHARESTANI M,CUDDIGAN J,et al.National pressure ulcer advisory panel’s updated pressure ulcer staging system[J].Dermatology Nursing,2007,19(4):343-349.

[2]WASSERMANN E,MV G,GSTALTNER K,et al.A chronic pressure ulcer model in the nude mouse[J].Wound Repair and Regeneration,2009,17(4):480-484.

[3]PEIRCE S M,SKALAK T C,RODEHEAVER G T.Ischemia-reperfusion injury in chronic pressure ulcer formation:a skin model in the rat[J].Wound Repair and Regeneration:Official Publication of the Wound Healing Society and the European Tissue Repair Society,2000,8(1):68-76.

[4]BLEBEA J,KERR J C,PADBERG F T J R,et al.Triphenyl tetrazolium chloride as a histochemical marker of skeletal muscle ischemia and reperfusion injury[J].Current Surgery, 1987,44(2):134-136.

[5]張純瑜,崔飛飛,張龍,等.IL-1在Ⅰ期壓瘡中的作用及表達[J].護理學雜志,2011,26(24):1-4.

[6]姜麗萍,蔡福滿,楊曄琴,等.不完全皮膚受壓對大鼠組織損傷影響的實驗研究[J].中華護理雜志,2007,42(9):776-778.

[7]蔡福滿,姜麗萍,楊曄琴,等.氧自由基損傷在壓瘡形成中的作用機制實驗研究[J].護理學雜志,2008,23(14):12-14.

[8]郭樹忠,汪良能,魯開化,等.自由基對缺血游離皮瓣的損傷和超氧化物歧化酶抗損傷作用的實驗研究[J].中國修復重建外科雜志,1995,9(2):104-107.

(本文編輯 黃建鄉(xiāng))

CREATION OF PRESSURE ULCER ISCHEMIC-REPERFUSSION MODEL IN RATS AND OBSERVATION OF RELATED INDICA-TORS

HUANG Qian,GAO Yufang,WEI Lili,LU Lianfang,ZHANG Hongyan,MA Xiaoyan (Qingdao University Medical College,Qingdao 266021,China)

ObjectiveTo create models of different-stage pressure ulcer ischemic-reperfusion(PUIR)in rats and analyze its related indicators.MethodsSixty-four Sprague Dawley rats were equally randomized to eight groups as follows:normal group,control group,stage-Ⅰ-,stage-Ⅱ-,stage-Ⅲ-,stage-Ⅳ-PU group,suspected-deep-tissue-injury group and hard-to-staging-PU group.A rat model of PUIR was created by implanting an iron plate in gluteus and pressed with magnetic iron from outside.The content of superoxide dicmutase(SOD),malondialdehyde(MDA),C-reactive protein(CRP)and tumor necrosis factor-α (TNF-α)in the local exudate in each group were detected.ResultsEach-stage rat PUIR models were successfully created.Compared with the normal group,the activity of SOD in each group of different-stage PUIR was declined,while the content of MDA and CRP elevated,the differences being significant(F＝55.54－156.90,q＝5.026－38.744,P＜0.05);as compared between each PUIR group,the differences of that showed significance as well(q＝4.086－33.642,P＜0.05).The content of TNF-αin local exudate in stage-Ⅲ-PU group was lower than that in the stage-Ⅳ-PU group(t＝5.82,P＜0.05).ConclusionConstructing sixstage PU animal models and identifying physiological changes in different stages of PU can provide theoretical basis for PU-related experimental research and clinical therapy.

pressure ulcer;ischemia;reperfusion injury;rats,Sprague-Dawley

R471

A

1008-0341(2013)04-0365-04

10.11712/qlyx201304028

2013-03-01;

2013-06-14

青島市科技局計劃課題(2010KZJ-37)

黃倩(1987-),女,在讀碩士研究生。

高玉芳(1959-),女,主任護師,博士生導師。