骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨缺損修復(fù)中的研究及應(yīng)用進(jìn)展＊

張 聰 綜述 孟純陽(yáng) 審校

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)寧272067）

骨缺損是臨床常見(jiàn)的疾病，是由創(chuàng)傷、腫瘤切除、畸形矯正以及感染等各種因素造成的。由于骨缺損造成骨結(jié)構(gòu)的改變，往往使骨的愈合成為奢望，即使能夠愈合，也常需要一年或更長(zhǎng)時(shí)間［1］，同時(shí)需要相關(guān)固定和制動(dòng)，且制動(dòng)臥床易導(dǎo)致多種并發(fā)癥，如褥瘡、呼吸系統(tǒng)感染、泌尿系統(tǒng)感染、患肢廢用性萎縮等，給家庭和社會(huì)造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)，也嚴(yán)重影響了患者的勞動(dòng)能力和生存質(zhì)量。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BM－MSCs）由Friedensten等［2］最先發(fā)現(xiàn)，其具有成骨分化潛能，取材方便、體外生長(zhǎng)迅速，在體外一定條件誘導(dǎo)下能夠定向分化為成骨細(xì)胞，并且有較強(qiáng)的傳代能力，回輸體內(nèi)后高效穩(wěn)定增值等優(yōu)點(diǎn)，成為修復(fù)骨缺損的良好種子細(xì)胞。對(duì)于嚴(yán)重或大塊骨缺損，即使我們采用自體骨、異體骨或組織工程骨植入，除植骨周?chē)猩倭考?xì)胞存活外，大部分骨缺損內(nèi)缺乏足夠的BM－MSCs，延遲了愈合時(shí)間。因此，向骨缺損部位引入足夠的BM－MSCs是促進(jìn)骨缺損修復(fù)的重要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)和前提條件［3］。BM－MSCs作為骨缺損修復(fù)的種子細(xì)胞已越來(lái)越受到關(guān)注，已經(jīng)成為21世紀(jì)再生醫(yī)學(xué)研究的主要熱點(diǎn)之一。筆者就BM－MSCs在骨缺損修復(fù)中的研究進(jìn)展綜述如下。

1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性

BM－MSCs來(lái)源于骨髓間質(zhì)，約占骨髓內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞數(shù)的1／104～1／55，并隨年齡的增加而減少，但是其擴(kuò)增能力很強(qiáng)，在指數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)間約需要30h左右，且其體外傳40代仍然具有干細(xì)胞特性。BM－MSCs就有跨系譜、跨胚層分化的潛能［4］，向內(nèi)中外三胚層分化，不僅可以分化為造血基質(zhì)細(xì)胞，還可以分化為許多造血以外的組織細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞等中胚層細(xì)胞，同時(shí)又有外胚層的神經(jīng)元細(xì)胞和內(nèi)胚層的肝卵圓細(xì)胞分化的能力。

BM－MSCs最初的分離培養(yǎng)方法系Friedensten在1987年建立的貼壁分離篩選法，目前用于BM－MSCs純化分離的方法主要包括4種：1）貼壁分離篩選法：也稱(chēng)全骨髓培養(yǎng)法，是根據(jù)BMMSCs貼壁生長(zhǎng)而造血系細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)的特性，通過(guò)定期換液以除去非貼壁細(xì)胞。此法雖被認(rèn)為粗糙，但操作簡(jiǎn)單方便，分離純度較高。2）密度梯度離心法：原理是根據(jù)估算中細(xì)胞成分比重不同及BM－MSCs的細(xì)胞密度大小，進(jìn)行密度梯度離，得到單個(gè)核細(xì)胞，再配合上述1）方式進(jìn)一步分離純化，其純度可達(dá)95%。3）流式細(xì)胞儀篩選法：主要是根據(jù)細(xì)胞大小來(lái)實(shí)現(xiàn)分離，利用一種有微小孔徑的的培養(yǎng)皿從骨髓中篩選BM－MSCs這種方法分離出BM－MSCs均質(zhì)性高，但細(xì)胞成骨活性低，培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)大多數(shù)不貼壁，并在24h內(nèi)死亡，可能是分選過(guò)程中機(jī)械剪切力造成了BM－MSCs損傷。4）免疫磁珠分離法：其原理是通過(guò)BM－MSCs表面帶有抗原成分或缺失抗原成分進(jìn)行篩選，從而得到相對(duì)純化的BM－MSCs，但是其無(wú)特有標(biāo)記分子，所以該方法在實(shí)際應(yīng)用中有一定的局限性［5］。

目前研究表明BM－MSCs并無(wú)獨(dú)特的表面標(biāo)志，實(shí)際應(yīng)用中，采用表面標(biāo)志和細(xì)胞形態(tài)學(xué)兩方面對(duì)BM－MSCs進(jìn)行鑒定是比較公認(rèn)的方法。2006年國(guó)際間充質(zhì)及組織干細(xì)胞委員會(huì)（the Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy）對(duì)hBM－MSCs（Human mesenchymal stem cells，hMSC）提出3條最低的鑒定標(biāo)準(zhǔn)1）在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下必須具備有對(duì)塑料瓶底物的貼壁特性。2）通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)BM－MSCs群體表達(dá)CD73、CD90、CD105的陽(yáng)性率大于95%，且CD34、CD45、CD14或CD11b、CD79a或CD19HLA－DR陽(yáng)性率表達(dá)低于2%。3）經(jīng)體外誘導(dǎo)必須能向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化。

2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化生長(zhǎng)的影響因素

BM－MSCs具有多向分化的潛能特性，而用于治療骨缺損中需要向成骨細(xì)胞分化。BM－MSCs體外誘導(dǎo)分化成骨主要經(jīng)歷了以下幾個(gè)階段：轉(zhuǎn)化期、增殖期、聚集分泌期、細(xì)胞外基質(zhì)鈣化期，在整個(gè)誘導(dǎo)分化過(guò)程中可以看到成骨因子含量增高，Ⅰ型膠原合成增多，鈣結(jié)節(jié)數(shù)量增多，逐漸變成具有成骨細(xì)胞生物活性的細(xì)胞。體外誘導(dǎo)BM－MSCs向成骨細(xì)胞分化可以使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基［6］，較為經(jīng)典的是使用地塞米松、維生素C、β－磷酸甘油，地塞米松可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟，同時(shí)提高堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）的活性，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分泌胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin－like growth factor，IGF），促進(jìn)細(xì)胞外膠原基質(zhì)合成；維生素C的作用是促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞合成膠原，調(diào)節(jié)三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、ALP活性和非膠原基質(zhì)蛋白的合成；β－磷酸甘油為成骨細(xì)胞提供磷酸離子，促進(jìn)生理性鈣鹽沉積、鈣化，從而加速鈣結(jié)節(jié)鈣化過(guò)程。

另外骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、IGF、1，25－（OH）2D3、透明質(zhì)酸均可促進(jìn)MSCs向骨組織分化［7］。

3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)骨缺損的相關(guān)研究進(jìn)展

BM－MSCs具有多向分化潛能，在體外特定實(shí)驗(yàn)條件下或自身骨愈合修復(fù)的微環(huán)境下可以向成骨細(xì)胞分化，具有良好的增殖和自身移植能力，其取材不存在倫理方面的爭(zhēng)議［8］，因此受到廣大組織工程學(xué)學(xué)者的青睞?，F(xiàn)根據(jù)其在骨缺損修復(fù)中應(yīng)用方法不同分以下幾類(lèi)：

3.1 BM－MSCs單獨(dú)應(yīng)用治療骨缺損

吳志玲等［9］抽取兔骨髓制成細(xì)胞懸液，體外分離培養(yǎng)BM－MSCs 2周。將培養(yǎng)2周的BM－MSCs注射到家兔單側(cè)橈骨缺損處，對(duì)側(cè)不予處理，于移植后第1、2、3、4周末，用鉬靶X線(xiàn)分別檢查雙側(cè)橈骨缺損處的骨形成情況，并取第4周末的骨痂進(jìn)行組織學(xué)檢查，結(jié)果顯示移植后實(shí)驗(yàn)側(cè)骨痂形成快于對(duì)照側(cè)；第4周末，實(shí)驗(yàn)側(cè)缺損處全部為骨性骨痂連接，對(duì)照側(cè)缺損處仍未形成骨痂連接，說(shuō)明BM－MSCs注射可以促進(jìn)骨缺損修復(fù)。Mcnulty等［10］認(rèn)為骨缺損區(qū)足夠量的MSCs是骨修復(fù)的必要條件，其預(yù)先使用MSCs動(dòng)員劑AMD3100，促使MSCs向外周血中聚集，在骨缺損處MSCs濃度可增加40倍，組織學(xué)和X射線(xiàn)檢查顯示骨修復(fù)效果優(yōu)于空白對(duì)照組。

3.2 非基因轉(zhuǎn)染BM－MSCs作為種子細(xì)胞應(yīng)用治療骨缺損

用BM－MSCs構(gòu)建組織工程骨有必不可少的3要素：具有向成骨方向誘導(dǎo)能力的間充質(zhì)干細(xì)胞、支架材料、誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化的生長(zhǎng)因子。Breitbart等［11］采用異體脫鈣骨（demineralized bone matrix DBM）體外與BM－MSCs復(fù)合培養(yǎng)后，植入股骨骨缺損的糖尿病小白鼠模型中，BM－MSCs／DBM組與DBM組在第4周、8周的組織學(xué)觀察了解到，BM－MSCs／DBM組有大量成骨細(xì)胞和骨基質(zhì)形成。該實(shí)驗(yàn)顯示出BM－MSCs作為種子細(xì)胞在可能會(huì)在糖尿病病人的骨缺損治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。NiemeyerP等［12］認(rèn)為人源干細(xì)胞具有低免疫源性、良好成骨細(xì)胞分化性，因此異種接種于骨材料上對(duì)大段骨缺損有良好修復(fù)作用，試驗(yàn)中采用脫鈣羥基磷灰石（calciumdeficient hydroxyapatite，CDHA）為支架材料，hMSC／CDHA、兔MSC／CDHA、CDHA分別植入家兔顱骨骨缺損處，組織學(xué)、影像學(xué)、生物力學(xué)檢測(cè)顯示出hMSC／CDHA組均差于其余兩組，說(shuō)明了雖然異種MSC具有低免疫源性，但進(jìn)行骨缺損治療中應(yīng)選取自體或同種MSC更為合適。Zhang等［13］認(rèn)為人富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）含 有 多 種 生 長(zhǎng) 因 子，如PDGF、TGF－β1、TGF－β2、IGF、EGF，它們對(duì)血管形成和細(xì)胞增殖發(fā)揮重要作用，同時(shí)PRP能夠提高BM－MSCs的增殖活性，增加細(xì)胞外基質(zhì)合成，增強(qiáng)成骨活性。以脫蛋白骨基質(zhì)（deproteinized bone matrix，DPB）為支架材料，將MSC／DPB組與異體PRP／DPB組治療家兔骨缺損，并通過(guò)組織學(xué)分析、X線(xiàn)顯影、骨密度測(cè)量顯示出良好的骨形成和再血管化，效果優(yōu)于單獨(dú)使用DPB的對(duì)照組；同時(shí)MSC／PRP／DPB組在骨缺損修復(fù)中的強(qiáng)效骨再生和再血管化又優(yōu)于上述3組。異體PRP具有低免疫源性、易獲得性，不額外增加病人的健康風(fēng)險(xiǎn)，自體MSC與異體PRP在骨修復(fù)中的協(xié)同作用將會(huì)在大段骨缺損治療中顯示出巨大的發(fā)展空間和應(yīng)用前景。Stockmannp等［14］分別分離出脂肪源性（adiposederived，AD）、骨膜源性（periosteum－derived，PD）、骨髓源性（bone marrow－derived，BD）間充質(zhì)干細(xì)胞做體外培養(yǎng)，將上述3種不同來(lái)源的MSCs種植于膠原支架上，然后將組織工程材料植入豬新鮮顱骨骨缺損處，并以空白支架為對(duì)照組，在早期（30d以?xún)?nèi)）實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在骨再生方面無(wú)差異，中期及后期（30～90d）3個(gè)實(shí)驗(yàn)組在骨質(zhì)含量、骨愈合方面與對(duì)照組相比均有明顯優(yōu)勢(shì)，且在整個(gè)試驗(yàn)階 段3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的AD－MSC、PD－MSC、BDMSC作為種子細(xì)胞修復(fù)骨缺損方面無(wú)明顯差異。Osuqi M等［15］采用IGF1、VEGF細(xì)胞生長(zhǎng)因子的條件培養(yǎng)基（Cultured conditioned media，CM）體外培養(yǎng)BM－MSCs，與其余4組無(wú)血清DMEM／瓊脂糖、無(wú)糖DMEM／瓊脂糖、PBS／瓊脂糖、空白組分別植入顱骨缺損小鼠模型中，術(shù)后8周，CT、組織學(xué)分析。CT顯示MSCs－CM組比其余4組有大量骨組織再生，建立良好的骨橋，組織學(xué)分析顯示骨缺損處有大量成骨細(xì)胞。在后期的生物力學(xué)檢測(cè)中MSCs／CM組的抗扭曲度、抗壓縮度均強(qiáng)于其余四組，說(shuō)明在一定的培養(yǎng)條件下BM－MSCs的骨缺損修復(fù)能力會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)。

3.3 帶有目的基因的BM－MSCs作為種子細(xì)胞應(yīng)用治療骨缺損

Cao等［16］將轉(zhuǎn)血管生成素－1（Angiopoietin－1，Ang－1）基因BM－MSCs種植于多孔β－磷酸三鈣（tricalcium phosphate，β－TCP）支架修復(fù)新西蘭大白兔橈骨骨缺損處，術(shù)后2、4周分別使用電子顯微鏡、組織學(xué)切片觀察骨細(xì)胞再生和微血管生成情況，與MSCs／β－TCP對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，術(shù)后12周生物力學(xué)測(cè)定顯示該組骨強(qiáng)度接近正常骨組織。由于使用了可有效持久釋放Ang－1，減弱了新生骨及新生血管在骨修復(fù)處處不能長(zhǎng)入或長(zhǎng)入緩慢的束縛，縮短了骨愈合時(shí)間。張波等［17］觀察重組BMP2和VEGF165轉(zhuǎn)染BMMSCs后的體外表達(dá)情況，并以含該轉(zhuǎn)染體系的組織工程骨進(jìn)行山羊顱骨骨缺損的修復(fù)研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因BM－MSCs在轉(zhuǎn)染后1～3周都可穩(wěn)定表達(dá)BMP2和VEGF，BM－MSCs和－TCP支架材料植入顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損處術(shù)后12周，組織學(xué)觀察聯(lián)合基因（BMP2／VEGF165）組有明顯成骨表現(xiàn)，骨組織結(jié)構(gòu)趨于正常，可見(jiàn)形成較多的類(lèi)骨樣組織，中間為骨基質(zhì)，表明攜帶該緩釋體系的新型組織工程骨是一種具有顯著成骨能力的優(yōu)良骨缺損修復(fù)材料。LIN等［18］以BMP4基因轉(zhuǎn)染兔BM－MSCs，轉(zhuǎn)染后的BM－MSCs體外培養(yǎng)觀察ALP、骨鈣素（osteocalcin，OCN）的表達(dá)情況，然后將其植入兔顱骨缺損進(jìn)行修復(fù)，結(jié)果提示BM－MSCs經(jīng)過(guò)BMP4基因轉(zhuǎn)染后存在較強(qiáng)成骨能力，與BMP4基因轉(zhuǎn)染脂肪來(lái)源干細(xì)胞組相比，兩者在體外成骨方面無(wú)較大的差異，同時(shí)BM－MSCs沒(méi)有分化脂肪細(xì)胞的趨勢(shì)。Hex等［19］采用將納米硫酸鈣／海藻酸鈉（nano－scale calcium Sulfate／Alginate，nCS／A）制作成膏狀與轉(zhuǎn)染BMP2基因的MSCs混合直接注入骨缺損部位的新方法，保證了支架材料內(nèi)部較高的MSCs數(shù)量和缺損修復(fù)區(qū)BMP2濃度，結(jié)果顯示，該方法與nCS／A組和nCS／A／MSCs組相比有更高的骨修復(fù)能力和微血管密度。

4 現(xiàn)存問(wèn)題與展望

雖然人們對(duì)BM－MSCs的研究和BM－MSCs應(yīng)用修復(fù)骨缺損的研究取得了顯著的成就，形成了自體骨移植、異體骨移植、組織工程骨移植修復(fù)骨缺損的3大領(lǐng)域，但是BM－MSCs作為種子細(xì)胞的應(yīng)用仍有一些問(wèn)題困擾、阻礙我們：1）分離純化細(xì)胞的方法需進(jìn)一步改進(jìn)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室仍是根據(jù)細(xì)胞貼壁的性質(zhì)分離細(xì)胞，細(xì)胞純度和功能不能令人滿(mǎn)意；2）未能找到鑒定MSCs特異性的標(biāo)記分子，鑒定標(biāo)準(zhǔn)不夠完善；3）BM－MSCs具有多向分化潛能，體外分化是否會(huì)引起細(xì)胞遺傳性質(zhì)的改變還有待進(jìn)一步證實(shí)；4）是否植入體外誘導(dǎo)具有成骨細(xì)胞特性后的BM－MSCs，還是完全依賴(lài)體內(nèi)誘導(dǎo)環(huán)境直接植入BM－MSCs；5）部分研究采用不同類(lèi)型的材料作為支架，但哪一種材料更有利于BM－MSCs生長(zhǎng)分化且生物相容性好，降解速度適當(dāng)，不良反應(yīng)小，仍需探索，同時(shí)最好能夠研制出既有骨傳導(dǎo)作用又有骨誘導(dǎo)作用的材料［20］；6）找到支架材料的最佳孔隙率、孔徑大小和最佳BM－MSCs的植入濃度，是今后亟待解決的問(wèn)題；7）臨床療效和安全性問(wèn)題是BM－MSCs及轉(zhuǎn)入某些基因后臨床治療時(shí)需要明確的根本問(wèn)題，體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的BMMSCs移植到體內(nèi)后是否會(huì)發(fā)生基因突變或?qū)е履[瘤等是臨床應(yīng)用中最令人擔(dān)憂(yōu)的問(wèn)題，因此，必須建立可靠的技術(shù)方法和安全評(píng)估體系；8）雙基因或多基因共轉(zhuǎn)染BM－MSCs，其所表達(dá)產(chǎn)物間是否存在協(xié)同作用或拮抗作用有待進(jìn)一步探明［21］；9）如何保持骨修復(fù)區(qū)MSCs足夠數(shù)量，是否有必要使用MSCs動(dòng)員藥物［22］；10）雖然BM－MSCs修復(fù)骨缺損有部分臨床報(bào)道，但多數(shù)還是在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)階段，過(guò)渡于臨床還需大量臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和大量實(shí)驗(yàn)的不懈探索，重組BM－MSCs和支架材料已成為研究熱點(diǎn)，持續(xù)的誘導(dǎo)因子和生長(zhǎng)因子分泌表達(dá)，模仿成骨微環(huán)境，良好骨傳導(dǎo)性和生物相容性支架材料等都是加快骨缺損修復(fù)的不可或缺條件，相信在不久的將來(lái)，BM－MSCs在臨床治療骨缺損中發(fā)揮更大的作用。

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