樹干畢赤酵母基因組文庫的構(gòu)建及纖維二糖酶基因的篩選

馬經(jīng)緯 ， 張 梁 *， 薛 衛(wèi) ， 石貴陽

（1.工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，發(fā)現(xiàn)新基因、研究新基因的功能已經(jīng)成為功能基因組研究的熱點(diǎn)。生物工程產(chǎn)業(yè)化更需要分離出有應(yīng)用價值的新基因[1]。構(gòu)建DNA基因組文庫是功能基因組學(xué)研究的基本手段，一個物種的基因組DNA包含了它所有的遺傳信息基因，可真實(shí)反映出基因組的全部信息[2]?；蚪M文庫不僅保存物種的遺傳信息，而且提供了一個篩選基因的平臺，可用于分離鑒定具有特定功能的基因[3-4]。

樹干畢赤酵母（Pichia stipitis）不僅可以發(fā)酵木糖、葡糖糖、甘露糖、半乳糖，還可以發(fā)酵纖維二糖和木二糖，對于纖維質(zhì)原料發(fā)酵產(chǎn)燃料乙醇具有重要意義[5-6]。樹干畢赤酵母已被證明具有良好的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用纖維二糖的能力，但該菌株產(chǎn)酒精的能力有限，無法在工業(yè)規(guī)模應(yīng)用[7]。近年來也有許多學(xué)者通過改變發(fā)酵條件提高樹干畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇的得率，但其生產(chǎn)能力距工業(yè)化還有一定的距離，這就凸顯出通過基因手段改造得到理想菌株尤為重要。

目前，對于樹干畢赤酵母的木糖利用酶系的研究已經(jīng)取得一定的進(jìn)展，樹干畢赤酵母基因組測序也已經(jīng)初步完成。但是，樹干畢赤酵母基因水平的研究正處于起步階段，許多關(guān)鍵的功能基因并沒有標(biāo)注，能夠檢索到的文獻(xiàn)甚少。其中，在其轉(zhuǎn)運(yùn)和利用纖維二糖方面的研究基本空白，僅推測得知該酵母基因組中有7個編碼β-葡萄糖苷酶的基因[8-9]。課題組前期根據(jù)文獻(xiàn)[9]對預(yù)測的7個基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，并連接表達(dá)載體后轉(zhuǎn)入釀酒酵母進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，但均未檢測獲得纖維二糖酶活性。

鑒于此，構(gòu)建樹干畢赤酵母的DNA基因組文庫，不僅將樹干畢赤酵母的遺傳信息以穩(wěn)定的重組體形式儲存起來，還可從中篩選、克隆和驗(yàn)證出新基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 樹干畢赤酵母CBS 5773，大腸桿菌JM109，釀酒酵母W303-1A，均保藏于江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源和信息中心；載體YEpLac181，由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 其他材料 蛋白胨和酵母膏，購自英國OXOID公司；蝸牛酶，購自Fermentas公司；Sau3AⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶，均購自NEB公司；氨芐青霉素，購自上海生工生物工程公司；X-Gal，IPTG，T4DNA連接酶，購自寶生物工程有限公司；其他試劑和藥品，均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 樹干畢赤酵母染色體DNA的提取

接種樹干畢赤酵母于YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min搖床過夜培養(yǎng)。取2 mL培養(yǎng)物至5 mL的離心管中，6 000r/min離心5min收集菌體；加入0.5mL酵母染色體提取試劑Ⅰ （0.1 mol/L Na2EDTA+0.9 mol/L山梨醇，pH 7.5）重懸菌體；加入30 μL的5 mg/mL蝸牛酶酶解細(xì)胞壁，37℃處理至大多數(shù)細(xì)胞形成原生質(zhì)體；6 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入0.5 mL酵母染色體提取試劑Ⅱ（20 mmol/L Na2EDTA+50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4）重懸菌體，并加入50 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%SDS，65℃保溫30 min裂解細(xì)胞；加入200 μL 5 mol/L醋酸鉀溶液，冰浴1 h；8 000 r/min離心8 min；取上清液移至干凈離心管中，在冰上加入等體積的異丙醇，放置15 min；6 000 r/min離心5 min；棄上清液，用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精洗滌沉淀兩次；待沉淀物干燥后加入適量的TE緩沖液（pH 7.4）或無菌水使溶解沉淀，-4 ℃保存[10]。

1.3 載體的制備

堿裂解法大量提取YEpLac181質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ酶切成線形，純化回收后用CIAP對YEpLac181/BamHⅠ去磷酸化處理。

1.4 樹干畢赤酵母基因組文庫的構(gòu)建及驗(yàn)證

采用微量稀釋法用內(nèi)切酶Sau3AⅠ部分酶切基因組DNA，同時取處理為線性的質(zhì)粒YEpLac181，Sau3AⅠ和BamHⅠ為同尾酶，利用T4DNA連接酶16℃將二者過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM-109感受態(tài)細(xì)胞，涂布含100 μg/mL的氨芐青霉 素 、20 μL 100 mg/mL 的 IPTG 和 100 μL 20 mg/mL的X-gal的LB平板，37℃恒溫箱培養(yǎng)，隨機(jī)挑取白色菌落接種于含100 μg/mL的氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床過夜培養(yǎng)，提取出質(zhì)粒BamHⅠ酶切電泳驗(yàn)證。

1.5 基因組文庫的保存

將藍(lán)白斑篩選所得白色菌落計數(shù)，用無菌牙簽將平板上的白色單菌落分別挑至無菌的96孔板，每個孔有100 μL含100 μg/mL的氨芐青霉素 LB液體培養(yǎng)基，封口膜封死37℃恒溫箱過夜培養(yǎng)，加等體積的體積分?jǐn)?shù)30%的甘油保存于-70℃。

1.6 基因組文庫的評估

根據(jù)所獲得的基因組文庫的克隆子的數(shù)目及平均插入片段的大小，依據(jù)公式:庫容量=文庫中陽性克隆子的數(shù)目×插人片段的平均大?。撋锘蚪M的大小計算出該基因組文庫的庫容量的大小。

根據(jù)Clarke-Carbon公式[11]，N為當(dāng)要求的克隆概率為P時，一個基因組文庫中所需的含有重組DNA的克隆數(shù)；P為克隆概率，即任一DNA片斷至少一份拷貝存在于該文庫的概率；f為限制片斷的平均長度與基因組DNA總長度之比。計算基因組文庫中所需的含有重組DNA的克隆數(shù)。

1.7 從文庫中篩選纖維二糖酶相關(guān)基因

分別提取構(gòu)建好的文庫大腸桿菌中的重組質(zhì)粒，用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將所提的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入釀酒酵母W303-1A中做游離表達(dá)，涂布YNBC平板30℃培養(yǎng)4 d左右。

挑取能夠在YNBC平板生長的酵母轉(zhuǎn)化株接種于YEPD液體培養(yǎng)基30℃搖床過夜培養(yǎng)，pNPG法測定纖維二糖酶酶活[12]。每分鐘每毫升酶液水解產(chǎn)生1 μmol對硝基酚（pNP）所需要的酶量定義為一個酶活單位。方法如下:離心分離菌體和發(fā)酵液，將所得菌體用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞，離心分離胞內(nèi)液體和細(xì)胞碎片。分別取0.2 mL經(jīng)適當(dāng)稀釋或濃縮的發(fā)酵液上清液、細(xì)胞碎片和胞內(nèi)液，加入1.8 mL 0.2 mol/L Na2HPO4+0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（pH 4.5），30℃預(yù)熱10 min后，加入已預(yù)熱的5 mmol/L對硝基酚-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）溶液2 mL，反應(yīng)10 min后立即加入2 mL 1 mol/L的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，室溫放置5 min后于400 nm處測定吸光度。以加熱失活的酶液按照同樣方法處理作空白。取轉(zhuǎn)化株所對應(yīng)質(zhì)粒的插入片段測序，得到纖維二糖酶相關(guān)基因序列。

1.8 生物信息學(xué)手段分析纖維二糖酶相關(guān)基因

將測序得到的堿基序列導(dǎo)入NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST程序進(jìn)行堿基同源性分析；將堿基序列翻譯成氨基酸利用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）工具進(jìn)行三維建模。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹干畢赤酵母基因組文庫的構(gòu)建

由于樹干畢赤酵母染色體基因組較大，用普通限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ等酶切8 h均未能獲得較為理想的片段組合。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，最終選擇采用Sau3AⅠ酶，該酶是識別4 bp的限制性內(nèi)切酶，完全酶切會產(chǎn)生平均256 bp的片段。通過微量稀釋法設(shè)置時間梯度和酶活梯度，對染色體基因組進(jìn)行酶切處理，確定了樹干畢赤酵母染色體基因的最佳酶切條件。

經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，樹干畢赤酵母染色體經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ稀釋100倍酶切6 h的片段大小在0.5 kb～8 kb之間，大多數(shù)片段在5 077 bp處，如圖1所示。

圖1 樹干畢赤酵母染色體經(jīng)Sau3AⅠ酶切片段1%的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 P.stipitis chromosome digested by Sau3AⅠwas analyzed by electrophoresis on 1%agarose gel

隨機(jī)挑取藍(lán)白斑篩選所得白色菌落接種含100 μg/mL的氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床過夜培養(yǎng)，提取出質(zhì)粒BamHⅠ酶切質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，如圖2所示。

圖2 質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ酶切1%的瓊脂糖凝膠電泳，2為空載的線性化載體YEpLac181Fig.2 Plasmids digested by BamHⅠwas analyzed by electrophoresis on 1% agarose gel，2 was YEpLac181 digested by BamHⅠ

共涂布10塊平板，每塊平板大約得300多個白斑，55個藍(lán)斑，共計得到300個陽性克隆子。根據(jù)公式計算出該基因組文庫的庫容量為:庫容量=3 000×5 000／15 441 179=97%。即該文庫中所含插入片段的總長度為樹干畢赤酵母基因組的0.97倍。

根據(jù)Clarke-Carbon公式，已知P=97%，即從該文庫篩選到樹干畢赤酵母任一DNA序列的精確概率為97%。計算得到N為1.08，即該文庫已經(jīng)覆蓋了樹干畢赤酵母的所有基因。

2.2 纖維二糖酶相關(guān)基因的篩選

根據(jù)1.7步驟，篩選獲得唯一一株能夠在YNBC平板生長的釀酒酵母轉(zhuǎn)化株，接種YEPD液體培養(yǎng)基30℃過夜培養(yǎng)后，離心分離發(fā)酵液上清液和菌體，將菌體超聲波破碎離心分離胞內(nèi)液和細(xì)胞碎片，pNPG法分別測定發(fā)酵液上清液、胞內(nèi)液和細(xì)胞碎片的纖維二糖酶酶活，結(jié)果見表1。在細(xì)胞碎片中測到纖維二糖酶酶活，說明該基因編碼的蛋白質(zhì)可在細(xì)胞間質(zhì)處起作用。

表1 發(fā)酵液上清、細(xì)胞碎片和胞內(nèi)液酶活比較Table 1 Cellobiase activity of supernatant of the medium，the cell wall and cell extracts

提取轉(zhuǎn)化株所對應(yīng)的質(zhì)粒，BamHⅠ酶切后瓊脂糖凝膠電泳，如圖3所示。將插入片段膠回收純化后測序，得到一段1 821bp的堿基序列。

圖3 轉(zhuǎn)化株對應(yīng)質(zhì)粒BamHⅠ酶切后1%瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Plasmid of transformation digested by BamHⅠwas analyzed by electrophoresis on 1%agarose gel

2.3 纖維二糖酶相關(guān)基因的分析

將測序得到的堿基序列導(dǎo)入BLAST程序沒有檢索到同源序列；利用SWISS-MODEL工具三維建模失敗。

3 結(jié)語

基因組文庫的構(gòu)建載體的濃度和純度的高低都直接關(guān)系到文庫構(gòu)建的成敗，空載的多少直接影響到文庫的質(zhì)量。為了避免空載現(xiàn)象，采取大提質(zhì)粒以增加載體的濃度，酶切成線性化后跑瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，將完全酶切呈線性的載體進(jìn)行膠回收防止污染，純化后用CIAP進(jìn)行脫磷處理以防止載體自連現(xiàn)象，再次瓊脂糖凝膠電泳回收純化備用。

高質(zhì)量的染色體基因是另一個構(gòu)建完整文庫的影響因素，樹干畢赤酵母染色體的各種提取方法原理相通，僅破裂細(xì)胞方法不同，大體分為物理法和酶法。物理法有液氮研磨法和玻璃珠震蕩破碎法，這種方法由于震動劇烈會使細(xì)胞核破裂從而染色體斷裂；而酶法采用蝸牛酶破壁形成原生質(zhì)體，再堿裂解細(xì)胞，相對溫和，大大減少了染色體的斷裂。染色體DNA的處理可以用物理機(jī)械剪切，也可以用限制性酶消化。機(jī)械切割法可獲得較均一的隨機(jī)片段，但片段不能直接用于克隆，需要經(jīng)過末端修飾，連上接頭后再用限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生黏性末端；直接用限制酶消化的方法則可以直接產(chǎn)生黏性末端，大大減少了工作量。

酵母菌中能夠降解纖維二糖的菌株很少，樹干畢赤酵母是其中比較重要的一種，雖然有研究根據(jù)同源性預(yù)測了其纖維二糖酶基因信息[8]，但通過實(shí)驗(yàn)無法驗(yàn)證其具有活性（數(shù)據(jù)另發(fā)）。本課題研究中通過構(gòu)建樹干畢赤酵母基因組文庫，以纖維二糖酶對底物纖維二糖的底物特異性篩選文庫所含基因，獲得一段P.stipitis來源的纖維二糖酶基因。該基因通過反復(fù)表達(dá)驗(yàn)證，具有明顯的纖維二糖水解活性。但其堿基序列通過BLAST檢索結(jié)果均為預(yù)測序列或未知序列，未找到同源序列，三維建模也沒有成功，表明該基因是一個新基因，這為樹干畢赤酵母纖維二糖代謝機(jī)理的研究提供了一個新的切入口，具有一定的學(xué)術(shù)意義。課題組接下來將進(jìn)一步對所獲得的基因進(jìn)行功能和調(diào)控機(jī)理等分析，并構(gòu)建高效利用纖維二糖的重組工業(yè)酒精酵母菌株。

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