內皮祖細胞與肝臟損傷修復

潘 可 綜述 李崇輝，張愛群，董家鴻 審校

解放軍總醫(yī)院 全軍肝膽外科研究所，北京 100853

內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，亦稱血管細胞(angioblast)，作為一種前體細胞能夠直接分化為血管內皮細胞(endothelial cells，ECs)。目前認為，骨髓是內皮祖細胞的主要來源，除此之外在血管內膜、脾臟、心肌、脂肪和肝臟等多種組織器官中也發(fā)現(xiàn)其存在。1997年，Asahara等[1]首次從循環(huán)外周血中分離出能夠直接分化為血管內皮的前體細胞，并為之命名為血管內皮祖細胞。近年的研究結果表明，EPCs在外周血管疾病、心腦血管疾病、腎臟疾病、腫瘤血管的形成以及創(chuàng)傷愈合等方面均發(fā)揮顯著作用[2-5]。目前與肝臟疾病相關的EPCs研究仍處于起步階段。本文對內皮祖細胞的生物學特性、功能及其參與肝臟損傷修復的研究進展概述如下。

1 EPCs概念

EPCs是一種來源于骨髓以及循環(huán)系統(tǒng)的單個核細胞，具有自我更新以及增殖并最終分化為血管內皮細胞的能力，暫無成熟的血管內皮細胞表型標記的表達；出現(xiàn)生理或病理等因素的刺激時能被動員至缺氧、缺血組織并分化為內皮細胞，促進血管的再生[6-7]。EPCs能夠分泌多種促進血管新生的細胞因子，其中包括血管內皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、肝細胞生長因子(HGF)以及白介素-8(IL-8)等[8]。未分化的EPCs呈圓形，已分化的EPCs呈梭形或紡錘形，僅僅從形態(tài)學水平很難與其他細胞加以區(qū)別，目前對于EPCs所采取的鑒定方法主要是依靠其細胞表型標記來進行，但迄今并無公認的明確統(tǒng)一的鑒定標準。表型特征為CD34+/CD133+/VEGF-R2+的細胞通常即可認為是EPCs。近年來的研究又發(fā)現(xiàn)，起源于臍血單核細胞的CD34+/CD14-或CD34-/CD14+的細胞也可分化為血管內皮細胞[9]。

EPCs的確切生物學特性仍有待進一步驗證，對于它們是否可以作為一種在結構與功能上同質的細胞群體的討論目前仍存在爭議。已知骨髓是EPCs的主要而非唯一來源，目前已經(jīng)在外周血、心肌及脂肪等多種不同的組織中分離出內皮細胞樣的干/祖細胞[10]。EPCs的來源有很多，包括Sca+骨髓成血管細胞、外周血來源CD34+/VEGF-R2+的單核細胞、CD34-側群細胞以及組織固有的前體細胞。最新觀點認為，內皮祖細胞是起源于造血干細胞或者成血管細胞亞群以及間充質干細胞的一類異質細胞的集合。通常說來，骨髓來源的EPCs同時表達三種標志物—CD34、VEGFR2(Flk-1)與CD133；而血液來源的EPCs則表達HSC、c-kit與Sca-1，隨著進一步分化失去早期標志物CD133進而開始表達VE-cadherin與von Willebrand factor(血管假性血友病因子)。

2 EPCs的功能與應用

循環(huán)系統(tǒng)中的EPCs在正常生理條件下含量并不多。缺血、局部血管損傷、燒傷、創(chuàng)傷以及細胞因子等各種刺激因素均能誘導骨髓中的EPCs動員進入外周血液循環(huán)系統(tǒng)，在相關因子的趨化作用下向缺血、缺氧組織或受損部位遷移，歸巢定植于內皮損傷處并最終增殖分化為成熟內皮細胞。歸巢的EPCs還具有促進相鄰內皮細胞增殖分化的能力。此外，EPCs不僅能夠促進血管生成，修復內皮損傷，還具有分泌多種促血管新生的生長因子的作用。

骨髓移植小鼠心肌梗死模型的組織學結果顯示，供體來源的內皮細胞定位于梗死緣帶的血管新生區(qū)域。Adams等[11]發(fā)現(xiàn)，運動誘導冠心病患者心肌缺血時，循環(huán)系統(tǒng)內EPCs水平升高。缺血可有效動員EPCs遷移，這一結論目前已經(jīng)在缺血性休克、心肌缺血以及腎缺血患者和實驗動物模型中得到證實。多種不同的細胞因子和趨化因子均參與EPCs的歸巢。Murayama等[12]證實在缺血部位移植含有VEGF的填充物，可引起移植部位骨髓來源EPCs的聚集，提高血管新生能力。在不同疾病或者同一疾病的不同階段，EPCs的數(shù)量與狀態(tài)會出現(xiàn)不同程度的變化?？赏ㄟ^檢測EPCs從而間接評估相關疾病的嚴重程度和進展階段，如心血管疾病的發(fā)生風險、糖尿病并發(fā)外周血管病的發(fā)病率以及抗癌藥物的療效等。目前已有少量臨床數(shù)據(jù)初步證實了自體EPCs細胞移植在急性心肌梗死方面的有效性[13]。

3 EPCs與肝臟損傷修復

3.1 EPCs用于肝纖維化治療研究 慢性肝臟損傷最終均可發(fā)展為肝纖維化、肝硬化乃至肝衰竭。肝損傷的防治已成為全球探討的嚴峻課題。目前治療肝損傷的策略主要包括以下幾個方面：促進肝細胞的再生，纖維化發(fā)生的防治，已有纖維化水平的逆轉以及促進正常肝結構的形成。盡管目前已存在很多治療肝損傷的方法，但至今仍無理想的臨床治療手段?，F(xiàn)有的藥物性治療多數(shù)存在療效有限、作用靶點單一和體內毒性聚積等弊端。細胞移植可作為一種損傷較小、并發(fā)癥相對較少的潛在有效途徑。參考目前EPCs在心血管與腎臟疾病領域初步的研究成果，試圖探索一條新的行之有效的肝臟損傷修復途徑。

骨髓來源的EPCs移植目前已被用于肝纖維化治療的研究。Taniguchi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在四氯化碳誘導的肝臟功能損傷小鼠體內注射的EPCs可在肝細胞凋亡的病灶處大量聚集，形成血管狀結構，明顯提高肝纖維化小鼠的存活率。Nakamura等[15]的研究結果顯示，移植單一或重復骨髓來源的EPCs后，可抑制肝星狀細胞的活化，增強基質金屬蛋白酶活性，調節(jié)肝細胞增殖，從而緩解大鼠肝纖維化程度。Liu等[16]在大鼠肝纖維化模型中證實，骨髓源EPCs移植可降低α-SMA、collagenⅢ與TGF-β的表達量，而四氯化碳處理所導致的albumin和Ki67的水平降低則恢復至正?！，F(xiàn)有的研究結果表明，VEGF分別通過與EPCs表面的兩種受體VEGF-R1、VEGF-R2的相互作用，促進EPCs的增殖，調節(jié)黏附分子的表達，進而實現(xiàn)對EPCs的動員；同時也可通過誘導造血因子如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(G-CSF)的釋放發(fā)揮動員作用。PDGF則可通過作用于VEGF-R1實現(xiàn)EPCs的動員，促進壞死部位的血管新生。此外，還有很多不同種類的生長因子，包括血管生成素-1(angiogenin-1)、成纖維細胞生長因子(fibmblast growth factor，F(xiàn)GF)和干細胞因子(stem cell factor，SCF)等也參與促進EPCs動員的過程。

EPCs移植可誘導生成促進肝再生、促進細胞外基質的降解或抑制細胞外基質生成的各種生長因子，促進肝細胞增殖，減緩肝纖維化進程，從而為肝臟疾病的治療提供一種前景光明的新手段。

3.2 EPCs與肝臟缺血性損傷 肝臟組織缺血損傷后，恢復血液灌流時會導致組織損傷進一步加劇。肝臟外科和肝臟移植過程均不可避免此種損傷。截至目前，肝臟移植物功能喪失和小肝綜合征始終是移植醫(yī)生所面臨的兩大難題，其發(fā)生和發(fā)展與肝臟缺血性損傷的關系極為密切。EPCs移植有望成為改善肝臟缺血性損傷的潛在手段。目前對外源性或自體擴增EPCs移植的研究主要集中于缺血組織血管新生、心血管疾病、腎臟疾病以及組織工程等幾個方面。在不同缺血動物模型中靜脈注射EPCs后，它們均可歸巢于缺血組織并促進新生血管的生成，但是注射成熟的內皮細胞后卻未見相似效應。Kawamoto等[17]將健康人血液來源的EPCs經(jīng)靜脈途徑注射至裸鼠急性心肌梗死模型，4周后觀察發(fā)現(xiàn)毛細血管密度增加，心臟功能得以改善。Hess等[18]將綠色熒光蛋白(GFP)標記的骨髓源EPCs移植入結扎大腦中動脈(MCA)的大鼠卒中模型，發(fā)現(xiàn)EPCs在缺血部位的血管區(qū)域聚集，表明骨髓源EPCs參與了腦缺血內皮細胞的再生，促進血管新生的發(fā)生。EPCs還能顯著改善肢體的缺血狀況，Kalka等[19]在后肢缺血的裸鼠動物模型中局部注射體外擴增的人源EPCs后發(fā)現(xiàn)，缺血區(qū)域毛細血管密度增加，組織血供明顯改善，缺血肢體的成活率顯著提高。此外，在組織工程化微血管中接種EPCs后可以改善其生物學特性，使之更接近于正常生理狀態(tài)，減少凝血以及栓塞的發(fā)生率[20]。具體作用機制可能是通過EPCs移植恢復血管的級聯(lián)生成，從而促進血管的新生、成熟與穩(wěn)定。

EPCs除可直接分化為血管內皮細胞外，還能通過自分泌/旁分泌的途徑參與血管內皮的受損修復，而其修復功效比單純給予任一種血管生成因子都更為顯著。EPCs在新生血管生成中的重要作用已在中風、皮膚損傷、肢體及心肌缺血等多種動物模型的研究中得到驗證，但是對于肝臟缺血再灌注損傷的治療研究還未見報道。然而我們可預期在多種肝臟疾病模型、肝臟移植過程中，骨髓來源的EPCs能夠通過其病變部位的趨化性及分泌血管生成因子等特性參與血管內皮的修復，改善肝組織損傷。

3.3 結合基因修飾的EPCs移植治療 將內皮祖細胞作為基因治療的載體進行創(chuàng)傷修復的研究正在進行中，目前常用的基因包括VEGF基因、SDF-1基因、內皮一氧化氮合成酶(eNOS)基因、端粒酶逆轉錄酶(TERT)基因、人低氧誘導因子1-α(HIF1-α)基因，成纖維細胞生長因子1(FGF1)基因等等。其中體外過表達的VEGF基因可增強EPCs的新生血管特性，提高創(chuàng)傷后修復功能，促進缺血動物模型新生血管的形成，而eNOS基因則是通過動員EPCs修復血管內皮的損傷，抑制損傷后新生內膜的過度增殖[21]。通過基因修飾改變細胞表型是用于改善EPCs生物學性狀的有效手段，提高對患者機體內各種不利因素的耐受能力，改善其治療效果。與單純移植EPCs到野百合堿誘發(fā)的肺動脈高壓大鼠相比，表達腎上腺髓質素的EPCs移植明顯具有更好的改善作用[22]。利用人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)可提高細胞增殖能力、延長細胞壽命等特性，EPCs轉染hTERT后，可增強其內膜修復與血管新生的作用，顯著挽救肢體損傷[23]。用表達VEGF-164基因的腺病毒載體轉染EPCs后發(fā)現(xiàn)，細胞的增殖、黏附等能力增強，不僅有效促進血管新生與血流恢復，同時顯著降低了肢體壞死與離斷程度[24]。轉染FGF1基因后，EPCs原有的遷移活性、成血管能力與存活力均得到明顯增強，從而能夠更好地改善豬慢性心肌缺血模型中缺血區(qū)域的血液灌流情況[25]。與此同時，采用基因治療的方法也可在一定程度上避免使用藥物動員EPCs時的全身不良反應。

EPCs在腫瘤的血管系統(tǒng)生成方面的作用目前仍存在爭議。現(xiàn)有的動物實驗已表明，在EPCs中導入編碼血管新生抑制因子的基因從而促使血管生成抑制劑在體內持續(xù)表達，可以明顯抑制腫瘤的生長。提示可將EPCs作為一種潛在的行之有效的細胞載體，用于轉運抑癌基因、抗血管生成因子、抗腫瘤藥物等，靶向于腫瘤病灶以抑制腫瘤生長，從而為腫瘤治療提供新一代的靶向工具，不失為未來腫瘤治療的發(fā)展方向[26]。

4 前景與展望

正常生理狀態(tài)下EPCs少量而不可或缺的存在于循環(huán)系統(tǒng)之中，一旦發(fā)生機體缺血、組織損傷和細胞因子刺激等情況，EPCs可從骨髓向靶部位動員、分化及增殖，形成新生血管，參與內膜修復。EPCs的這種特性在未來肝損傷修復的研究與治療領域具有重要的意義與廣泛的應用前景。但目前仍然存在很多亟待解決的問題，例如表面標記物的確定與篩選，體外的有效分離純化，體內的安全有效擴增，以及避免與治療相關的各種不良反應等。作為近年研究的熱點，EPCs作為肝損傷修復的新手段，有望在不久的將來用于臨床治療肝損傷。

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