新城疫抗體測(cè)定的規(guī)范操作

向雙云，周珍輝

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 房山 102442）

1 測(cè)定的器材及使用方法

1.1 托盤天平

托盤天平測(cè)量開始前，必須先將游碼移到標(biāo)尺左端的零刻度處，然后才開始調(diào)節(jié)平衡螺母，使天平平衡。若將平衡螺母左右移至盡頭天平仍不得平衡，則應(yīng)檢查原因，不能移動(dòng)游碼來達(dá)到平衡。

1.2 離心機(jī)

離心機(jī)使用時(shí)離心管液體不能裝得太滿，對(duì)稱放置的試樣必須配平。

1.3 移液槍

移液槍吸頭裝配時(shí)需將移液器垂直插入吸頭，左右微微轉(zhuǎn)動(dòng)，上緊即可，切勿用移液器反復(fù)撞擊吸頭來上緊。

1.4 移液器

移液器吸液時(shí)應(yīng)垂直吸液，吸頭尖端侵入液面3mm以下，吸液時(shí)槍頭應(yīng)預(yù)潤(rùn)濕，然后再正式移液。吸液可將按鈕按到第一檔吸液，釋放按鈕。放液時(shí)先按下第一檔，打出大部分液體，再按下第二檔，將余液排出。吸取的過程應(yīng)該做到“慢吸快打”，在吸液時(shí)要慢、準(zhǔn)，放液時(shí)對(duì)準(zhǔn)后速度要快，可以避免打完后吸頭下存留液體，保證加入的液體體積一致。

2 規(guī)范的采血方法

采血前采血者先將注射器內(nèi)吸入3.8%的枸櫞酸鈉。采血時(shí)，一人將雞側(cè)臥保定，一人固定雞的頭部和腳；從側(cè)翅膀采血，一手固定采血部分，一手采血；采血完畢后采血者一手將抗凝劑和血液輕輕搖勻，一手用干棉球按壓采血部位止血。采血部位最好從翅靜脈叢刺入，比較容易采血成功且不容易淤血。

3 紅細(xì)胞懸液的配制

血液采集完畢需取下針頭，把血液沿離心管的管壁緩慢注入離心管中，防止紅細(xì)胞的破壞。然后輕輕來回晃動(dòng)離心管，使血液與抗凝劑充分混合，配平后置于離心機(jī)中開始離心。離心完畢，應(yīng)先選用5mL的移液器吸取上面的液體，然后再選用1 mL或200μL的移液器吸取，最好以畫圈的方式吸取，比較容易把白細(xì)胞和血小板吸干凈。最后一次離心完畢，按照計(jì)算量用移液器從離心管底部吸取紅細(xì)胞放入加好生理鹽水的燒杯中，再反復(fù)回用生理鹽水將移液器吸頭里的紅細(xì)胞洗下來，保證配制紅細(xì)胞濃度的準(zhǔn)確性。

4 血凝試驗(yàn)

血凝試驗(yàn)操作過程中需要注意的是使用微量移液器吸取液體時(shí)，吸頭需碰壁以除去多余的液體；加樣時(shí)應(yīng)將所加物在V型板的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出；倍比稀釋時(shí)，要注意避免產(chǎn)生過多的氣泡，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性；加紅細(xì)胞時(shí)最好懸滴或由后往前加，因?yàn)榭變?nèi)已有稀釋的抗原，如果吸頭接觸到孔內(nèi)混合液，會(huì)造成各個(gè)孔間液體相互污染，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)誤差。抗原懸液在使用前一定要搖勻，紅細(xì)胞懸液要邊搖邊加，以保證每一孔中加入濃度的準(zhǔn)確一致，但注意不要用力過大，防止紅細(xì)胞被破壞，造成溶血。結(jié)果判斷應(yīng)按照操作規(guī)程規(guī)定的時(shí)間，在對(duì)照孔成立的前提下及時(shí)觀察讀數(shù)，讀數(shù)過早，血凝價(jià)易判高，血凝抑制價(jià)易判低，讀數(shù)過晚，紅細(xì)胞發(fā)生裂解，結(jié)果不再有意義。

5 四單位病毒的配制

四單位病毒的配制應(yīng)根據(jù)計(jì)算結(jié)果用大移液器先吸取生理鹽水，然后用小移液器吸取抗原，抗原吸取前要搖勻，再反復(fù)用生理鹽水將移液器吸頭里的抗原洗下來，保證配制四單位病毒濃度的準(zhǔn)確性。配制好的四單位病毒最好能進(jìn)行回歸試驗(yàn)檢測(cè)，回歸試驗(yàn)的操作方法是：在微量反應(yīng)板的1～4孔均加入0.025mL生理鹽水，取四單位病毒液0.025mL加入第1孔內(nèi)，混勻后吸取0.025mL加入第2孔，依次倍比稀釋至第4孔，從第4孔吸取0.025mL棄去。然后每孔再加入0.025mL1%雞紅細(xì)胞懸液，輕輕混勻，室溫（20℃～25℃）下靜置40min后觀察結(jié)果。若第1孔，2孔凝集，則視為抗原配制正確；若第1孔凝集，第2孔、3孔、4孔均沉淀，則抗原濃度配制偏低；若前3孔均凝集第4孔沉淀，則抗原濃度配制偏高。

6 血凝抑制試驗(yàn)

血凝抑制試驗(yàn)操作過程中加樣的注意事項(xiàng)與血凝試驗(yàn)基本相同，主要注意四單位病毒和紅細(xì)胞懸液加樣時(shí)要滴或由前往后滴加，避免移液器吸頭與孔內(nèi)的液體接觸，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。血清要搖勻后加樣，四單位病毒和紅細(xì)胞懸液要邊搖勻邊加樣，保證每孔所加的樣品量和濃度的準(zhǔn)確性。判定結(jié)果的時(shí)間要嚴(yán)格控制，一般來說，以陽性和陰性對(duì)照成立，紅細(xì)胞對(duì)照孔完全沉淀的前后5min內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果較好。試驗(yàn)結(jié)果判讀時(shí)，微量反應(yīng)板傾斜45°，孔底沉淀的紅細(xì)胞流動(dòng)性好，呈淚珠樣流淌，邊緣無凝集顆粒的為凝集完全抑制，以能完全抑制四單位病毒的血清最高稀釋度作為血凝抑制滴度。

綜上所述，在新城疫抗體測(cè)定中，影響試驗(yàn)結(jié)果的因素很多，只有嚴(yán)格按規(guī)定操作，細(xì)致、耐心地做好每一個(gè)環(huán)節(jié)，發(fā)現(xiàn)問題找出原因，及時(shí)糾正處理，才能保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確。