多形擬桿菌對仔豬腸道菌群的影響

蔡艷,胡善輝，付金衡,儲玉雙,萬培偉,黃曉紅

（1.江西生物科技職業(yè)學院，江西 南昌 330200；2.南昌大學中德聯(lián)合研究院食品科學與技術(shù)國家重點實驗室）

擬桿菌(Bacteroidetes)是一種革蘭氏陰性,桿狀、兩端鈍圓而濃染，形態(tài)一致或多形態(tài)的專性厭氧菌。它分離自人和其他動物的自然體腔和昆蟲的腸道[1]，擬桿菌是人和動物體內(nèi)大量存在正常的菌群,約占成年個體內(nèi)腸道菌群1/4以上[2]，與其他菌群以及和宿主之間有著微妙而復雜的關(guān)系,對宿主的健康起著非常重要的作用。

多形擬桿菌廣泛分布在哺乳動物體內(nèi)，是人類和動物腸道的主要細菌之一，常作哺乳動物體細菌的一個代表來研究宿主與微生物之間的營養(yǎng)物質(zhì)代謝共生關(guān)系[3～5]。這種共生關(guān)系的研究可以揭示細菌如何影響動物和人體的生物學過程使自身和機體都受益，為動物和人類的健康及營養(yǎng)物質(zhì)的合理利用提供新線索，并為預(yù)防和治療各種疾病提供新策略[6～9]。

研究表明，多形擬桿菌能夠根據(jù)食物來源的變化,將自身的基因1/4以上調(diào)節(jié)到活躍狀態(tài)[10]。這一發(fā)現(xiàn)讓科學家對腸道菌群有了更新的認識[11]。每當宿主的食譜變化時，多形擬桿菌就能夠迅速調(diào)節(jié)自己體內(nèi)的基因組,更好更快地消化新食物，在為宿主提供營養(yǎng)的同時也為自己和腸道中其他的細菌獲得食物，這樣就維持了整個腸道菌群的健康。此外，多形擬桿菌能降解一類動物和人體所不能被消化的植物多糖，動物和人體腸道幾乎不含多糖消化酶,但是多形擬桿菌卻能編碼64種多糖降解相關(guān)的酶,從而降解多糖,為宿主提供了額外的能量[12]。碳水化合物來源的能量,其中有10%～15%依賴于腸道細菌的酵解。實驗表明，接種多形擬桿菌10d后的小鼠,其盲腸內(nèi)己糖的的濃度顯著下降[13]，提示細菌可以促進宿主對單糖的吸收。因此,多形擬桿菌對機體糖代謝影響可能是肥胖的另一大誘因。

1 多形擬桿菌的益生作用

對于多形擬桿菌的益生作用，很多國外的學者從不同的方面進行了大量研究，發(fā)現(xiàn)多形擬桿菌在幫助宿主吸收多糖以及提高營養(yǎng)利用率、調(diào)控脂肪的積累[14]、加快腸道黏膜的血管形成和提高宿主的免疫力、維持腸道微生態(tài)平衡等方面均有著非常重要的作用。特別是多形擬桿菌在對多糖的利用方面的作用尤其突出。這一作用不僅賦予了多形擬桿菌更易于利用其他菌不能消耗的多糖能力，也減少了對營養(yǎng)源的競爭，奠定了其優(yōu)勢地位；而且多形擬桿菌在代謝多糖過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，還可以為宿主提供營養(yǎng)[15～18]。這一重大發(fā)現(xiàn)對研究動物和人體的肥胖有重要的意義。特別在增加豬肉瘦肉率上可供參考。

除此之外，斷奶仔豬的腹瀉是一個讓人頭痛的問題，尤其是斷奶的仔豬腸道菌群嚴重失調(diào),功能出現(xiàn)了紊亂,即使使用很多的藥物也是無濟于事,反而還可能更加破壞腸道的菌群平衡。使用多形擬桿菌可恢復腸道的微生態(tài),使有益菌群快速的增殖從而改善腸道功能,可以有效地解決腹瀉的問題。

2 材料與方法

2.1 材料

主要儀器：超凈工作臺,顯微鏡,厭氧培養(yǎng)箱,XW～80A漩渦混合器,80-2離心機等。

選擇性GAM培養(yǎng)基的配方：大豆胨3.0g,胨10g,多形擬桿菌的發(fā)酵提取液5.0g,牛肉膏2.3g,葡萄糖3.0g,磷酸二氫鉀2.5g,氯化鈉5.0g,可溶性淀粉5.0g,L～Cys鹽酸鹽0.3g,硫乙醇酸鈉0.3g,蒸餾水1 000mL。pH7.4，121℃,高壓滅菌20min后,冷卻至50℃～60℃,加入無菌氯化血紅素0.003g,新霉素0.1 mg/mL,萬古霉素0.001mg/mL,卡那霉素0.1mg/mL。

CDC厭氧血瓊脂培養(yǎng)基配方：胰酪蛋白胨15.0 g,大豆蛋白胨5.0g,酵母粉5.0g,氯化鈉5.0g,L-胱氨酸鹽酸鹽0.4g,瓊脂15.0g,蒸餾水1000mL。pH 7.5,121℃高壓滅菌20min后,冷卻至45℃～50℃,加入5%無菌羊血、無菌氯化血紅素0.005g和無菌維生素K0.01g。

實驗動物：體重7kg左右的商品仔豬。

2.2 實驗方法

2.2.1 多形擬桿菌的分離與鑒定。從健康豬糞便中提取分離出1株多形擬桿菌,進行耐氧實驗、糖發(fā)酵試驗、膽汁試驗、七葉靈試驗以及基質(zhì)試驗[18]。

2.2.2 飼養(yǎng)試驗及樣品采集。將40頭28日齡斷奶、體重7kg左右的商品仔豬依體重和窩別隨機分為4個處理組,每組10頭(母豬和去勢公豬各半)。飼料喂養(yǎng)，對照組飼喂基礎(chǔ)日糧,試驗組分別飼各喂添加100mL108cfu/mL，109cfu/mL,1010cfu/mL濃度的目示多形擬桿菌菌液的飼糧。試驗豬自由采食和飲水,預(yù)試期5d,正試期35d。記錄耗料量、空腹始重和末重。每日觀察仔豬排糞情況,記錄腹瀉個體、持續(xù)時間。以每重復仔豬發(fā)生腹瀉的頭日數(shù)除以總的飼養(yǎng)頭日數(shù)計算腹瀉率。飼養(yǎng)試驗結(jié)束時,從對照組和其他3組中分別選擇體重相近的6頭豬(公母各半),前腔靜脈采血,分離血清樣品,置-20℃冰箱保存,待檢。然后全部屠宰,無菌采取結(jié)腸內(nèi)容物作腸道菌群分析[19]。

3 結(jié)果

3.1 多形擬桿菌分離與鑒定結(jié)果

多形擬桿菌在CDC血瓊脂平板上菌落形狀如點滴狀、細小、圓形、全緣、凸起、半透明、帶白色、軟而發(fā)亮、羊血平板上不溶血,革蘭染色后,油鏡觀察為陰性桿菌,見圖1、圖2。

圖1 多形擬桿菌在CDC血瓊脂培養(yǎng)基上的形態(tài)

圖2 多形擬桿菌在油鏡觀察下的形態(tài)

3.2 生化鑒定實驗結(jié)果（見表1）

表1 生化鑒定結(jié)果

3.3 多形擬桿菌對仔豬腸道菌群的影響

使用SPSS統(tǒng)計軟件進行顯著性分析，并進行多重比較，測定結(jié)果以平均數(shù)±標準差（x±s）表示。（見表2）

表2 各組仔豬腸道內(nèi)容物菌落計數(shù)LgCFU/g

4 討論

從表2可以看出，與空白對照組相比，灌胃多形擬桿菌菌液的3個實驗組的擬桿菌數(shù)量都增加了，且差異極其顯著（P＜0.01）。這說明多形擬桿菌已在仔豬腸道定植，而且已成為一種優(yōu)勢菌群。但是相比對照組的腸道內(nèi)其他菌群如大腸桿菌，卻在減少，顯著差異（P＜0.05）。大腸桿菌減少，也有助于預(yù)防仔豬腹瀉的發(fā)生。

與對照組相比，雙歧桿菌在3個實驗組的數(shù)量都增加了，顯著差異（P＜0.05）。但是乳酸菌的數(shù)量增加不明顯，差異不顯著（P＞0.05）。

乳酸桿菌、雙歧桿菌等益生菌在防病促生長方面具有協(xié)同作用。動物腸道內(nèi)乳酸桿菌等益生菌的增殖,能促進宿主代謝,分解碳水化合物,產(chǎn)生多種有機酸,增加維生素合成,提高機體的消化機能,促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,還能競爭性地抑制腸道內(nèi)有害菌的增殖,外源性多糖、有機酸等營養(yǎng)物質(zhì),可促進動物腸道正常微生物菌群的增殖。試驗研究結(jié)果顯示,灌喂多形擬桿菌菌液的仔豬腸道菌群發(fā)生了顯著地變化,益生菌的數(shù)量在增加,致病菌（如大腸桿菌）的數(shù)量在減少，維持了仔豬腸道微生態(tài)平衡，很可能有助于提高仔豬免疫力和預(yù)防仔豬腹瀉的發(fā)生。

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