遺傳因素在后縱韌帶骨化癥發(fā)生機(jī)制中的作用

張頡鴻，劉 洋，袁 文

后縱韌帶骨化癥(ossification of the posterior longitudinal ligament，OPLL)是指脊柱后縱韌帶發(fā)生異位骨化，骨化物壓迫脊髓和神經(jīng)根后出現(xiàn)神經(jīng)功能損害癥狀的疾病。該病常見于頸椎，在亞洲中老年人群中高發(fā)，男性多見，可與其他脊柱退行性病變并存［1］。目前認(rèn)為OPLL 是由多種因素共同引起，如遺傳、代謝異常及機(jī)械應(yīng)力刺激等。本文就OPLL遺傳基因研究做一歸納，并闡述了在機(jī)械應(yīng)力環(huán)境下易感基因?qū)PLL 發(fā)病的影響;此外，本文又簡述了微RNA(microRNA，miRNA)在調(diào)節(jié)OPLL 易感基因成骨表達(dá)方面的研究進(jìn)展，以便探討遺傳因素(OPLL 易感基因及miRNA)在OPLL 發(fā)生機(jī)制中的作用。

1 OPLL 主要易感基因

OPLL 發(fā)病帶有明顯的遺傳傾向，且與多個基因相關(guān)。Matsunaga 等［2］對24 例頸椎OPLL 患者的家庭成員進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)帶有較多人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)單倍體的家庭成員OPLL 發(fā)生率較高:若HLA 單倍體為雙線性，OPLL發(fā)生率為53%(10/19);若為單線性單倍體，OPLL的發(fā)生率為24% (5/21);若無HLA 單倍體，OPLL發(fā)生率為4.8%(1/21)。排除一些目前尚有爭議的基因，如核苷酸焦磷酸基因、維甲酸X 受體基因、維生素D 受體基因、瘦素受體基因等，現(xiàn)就目前研究認(rèn)為與OPLL 相關(guān)性較大的基因作如下歸納。

1.1 COL11A2 基因

Maeda 等［3］研究發(fā)現(xiàn)，OPLL 患者COL11A2 基因的內(nèi)含子6 的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與正常人群有明顯差異;還發(fā)現(xiàn)COL11A2 基因內(nèi)含子6 的1 個SNP 在男女性之間有顯著差異，該因素是否會造成OPLL 發(fā)病的性別差 異 有 待 進(jìn) 一 步 研 究。Tanaka 等［4］也 發(fā) 現(xiàn)COL11A2 基因與OPLL 發(fā)病有較強(qiáng)的相關(guān)性。

1.2 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (bone morphogenetic protein-2，BMP-2)基因

Wang 等［5］研究發(fā)現(xiàn)BMP-2 基因中的Ser37Ala和Ser87SerSNP 與中國人OPLL 遺傳易感及嚴(yán)重程度相關(guān)。他們發(fā)現(xiàn)Ser37Ala(T/G)SNP 與OPLL 的發(fā)生明顯相關(guān)，與骨化范圍和嚴(yán)重程度無關(guān);Ser87Ser(A/G)SNP 與骨化范圍和嚴(yán)重程度明顯相關(guān)，而與OPLL 發(fā)生率無關(guān)。該研究證實(shí)，BMP-2 基因不僅與OPLL 發(fā)生有關(guān)，也與其進(jìn)展和嚴(yán)重程度有關(guān)。其中，Ser37Ala(T/G)SNP 中的G 等位基因與OPLL 發(fā)生率相關(guān);Ser87Ser(A/G)SNP 中的G 等位基因促進(jìn)骨化進(jìn)展，而A 等位基因限制骨化進(jìn)展。

1.3 轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)基因

Kamiya 等［6］用等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)法對319 例沒有親屬關(guān)系的日本人進(jìn)行TGF-β1 基因分型研究，其中OPLL 患者46 例，對照組273 例，多元回歸分析顯示OPLL 患者該位點(diǎn)是C 等位基因的比例遠(yuǎn)高于對照組，表明TGF-β1 基因的T869 位點(diǎn)上C 等位基因是OPLL 遺傳易感性的危險因素。Horikoshi 等［7］對711 例OPLL 患者和896 例對照組人群進(jìn)行分析研究，對35 個候選基因共109 個SNPs 進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 個基因的5 個SNPs 與OPLL 相關(guān)，其中TGF-β3 基因的1 個內(nèi)含子SNP(IVS1-1284G ＞C)與疾病最為密切相關(guān)。

1.4 COL6A1 基因

Kong 等［8］根據(jù)OPLL 發(fā)生相關(guān)的COL6A1 基因SNP 位點(diǎn)，對338 名漢族人(183 名患者和155 名對照者，183 名患者中包含OPLL 90 名、黃韌帶骨化癥(ossification of the ligamentum flavum，OLF)61 名、同時伴有OPLL 和OLF32 名進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)OPLL患者和OLF 患者COL6A1 基因的幾個基因位點(diǎn)如:啟動子(-572)、內(nèi)含子32(-29)、內(nèi)含子33(+20)SNP 改變單倍體的頻率明顯較對照組高，指出COL6A1 基因SNP 單倍體的出現(xiàn)與OPLL、OLF 的發(fā)生明顯相關(guān)。提示COL6A1 基因可能是中國漢族人群OPLL 致病的易感基因。

1.5 Runx2 基因

Runx2 是間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子［9］。Kishiya 等［10］為了解Runx2 與OPLL 關(guān)系，通過DNA 微陣列檢測Runx2 基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OPLL 患者Runx2 基因表達(dá)增強(qiáng)，OPLL 細(xì)胞培養(yǎng)后應(yīng)用RNA 干擾技術(shù)抑制Runx 基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)成骨標(biāo)志物(堿性磷酸酶、骨鈣素等)和促血管生成素-1 表達(dá)明顯下調(diào)，而正常細(xì)胞沒有明顯差異，提示Runx2 基因在脊柱韌帶異位骨化發(fā)展過程中起重要作用。Liu 等［11］針對中國漢族人群進(jìn)行了一項(xiàng)大樣本SNP 研究，發(fā)現(xiàn)在OPLL 和OLF 患者中Runx2 基因的2 個位點(diǎn)RS1321075 和RS12333172的SNPs 與對照組有差異，其中一個位點(diǎn)的單倍體分型顯示與OPLL 和OLF 的發(fā)生有關(guān)。提示Runx2基因可能是中國漢族人群OPLL 致病的易感基因。

綜合近10 年OPLL 遺傳學(xué)研究的進(jìn)展，目前發(fā)現(xiàn)與OPLL 發(fā)生相關(guān)的基因主要有COL11A2，TGFβ，COL6A1，BMP-2，Runx2 等，以上基因均對骨代謝有著重要調(diào)節(jié)作用。相比之下，BMP-2 基因與OPLL 關(guān)系可能更為密切，它不僅與OPLL 的發(fā)生相關(guān)，還調(diào)控OPLL 骨化的繼續(xù)進(jìn)展，因此其對OPLL的發(fā)生、發(fā)展全過程可能都有調(diào)控作用，其中，Runx2 是BMP 成骨信號通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，在缺少Runx2 基因調(diào)節(jié)時，BMP-2 無法促使骨化［12］。然而，雖然有研究證明OPLL 患者中Runx2 基因存在變異［11］，但OPLL 發(fā)生與該基因突變直接相關(guān)的證據(jù)仍然不足，尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

2 在機(jī)械應(yīng)力環(huán)境下易感基因?qū)PLL 發(fā)生的影響

目前認(rèn)為，OPLL 是一類在特定環(huán)境(如持續(xù)力學(xué)刺激作用下)罹患的遺傳疾病，眾多研究證實(shí)，機(jī)械應(yīng)力刺激在脊柱韌帶骨化的發(fā)生機(jī)制中起著重要作用［13］。生物力學(xué)的影響貫穿于整個韌帶骨化過程中，骨化的進(jìn)展程度與應(yīng)力刺激條件的變化關(guān)系密切。Matsunaga 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，頸椎的前屈、后伸、側(cè)屈活動及髓核組織的突出直接導(dǎo)致患者頸椎間盤應(yīng)力分布異常、后縱韌帶張力增高，這種對于后縱韌帶的機(jī)械刺激直接加速了OPLL 進(jìn)程。Takatsu等［15］對97 例頸椎OPLL 術(shù)后患者進(jìn)行放射學(xué)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，后路手術(shù)加速了OPLL 的進(jìn)展，認(rèn)為后路手術(shù)破壞了頸椎后方結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致頸椎不穩(wěn)，后縱韌帶張力增加，使骨化明顯進(jìn)展。Tsukamoto 等［16］通過反復(fù)牽拉刺激成年Wistar 大鼠的尾椎，2 周后發(fā)現(xiàn)韌帶內(nèi)BMP-2 明顯表達(dá)，并有軟骨形成，提示機(jī)械應(yīng)力刺激在韌帶骨化過程中起重要作用。

Runx2 是成骨細(xì)胞分化所必需的基因。研究證實(shí)Runx2 不僅調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化，還能通過促進(jìn)骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成，如Ⅰ型膠原、骨鈣素、纖維連接蛋白等，來調(diào)節(jié)成熟的成骨細(xì)胞成骨［17-18］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)Runx2 基因能介導(dǎo)細(xì)胞外應(yīng)力刺激，促使細(xì)胞向成骨方向分化，異位骨化也與之有關(guān)［19］。一項(xiàng)SNP 研究發(fā)現(xiàn)OPLL 患者中Runx2 基因存在變異［11］，認(rèn)為Runx2 是OPLL 易感基因。Xue 等［20］建立創(chuàng)傷后異位骨化的家兔模型，再將人工合成的特異siRNA 注射入家兔創(chuàng)傷部位，來干擾Runx2 基因表達(dá)，10 周后觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，干預(yù)組創(chuàng)傷部位骨化組織明顯減少，作者認(rèn)為通過抑制Runx2 基因來防治異位骨化是一種可行的方法。

大量研究發(fā)現(xiàn)Runx2 基因是機(jī)械應(yīng)力刺激細(xì)胞成骨分化的重要靶點(diǎn)。Ziros 等［21］實(shí)驗(yàn)證實(shí)，力學(xué)刺激通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)通路，將力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)Runx2 基因表達(dá)，提高Runx2 蛋白與下游基因DNA 的結(jié)合力，并使Runx2 蛋白磷酸化，能促使細(xì)胞向成骨方向分化成熟。而在模擬臥床及失重狀態(tài)下的滾筒中及實(shí)際的失重狀態(tài)下，細(xì)胞Runx2 基因表達(dá)和成骨分化均受抑制。Iwasaki等［22］、Tanno 等［23］將周期性拉力作用于來自O(shè)PLL患者和非OPLL 患者的脊柱韌帶組織及其原代培養(yǎng)的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)拉力作用下的OPLL 患者韌帶組織和細(xì)胞的Runx2 蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，且骨鈣素、堿性磷酸酶等成骨標(biāo)志物也表達(dá)增高，而無拉力作用的對照組表達(dá)無差異。同樣，Cai 等［24］研究發(fā)現(xiàn)體外機(jī)械應(yīng)力作用于OLF 患者來源的黃韌帶原代細(xì)胞，24 h后發(fā)現(xiàn)Runx2 基因表達(dá)較對照組明顯增高，OLF 患者黃韌帶組織免疫組化結(jié)果也顯示Runx2 蛋白分布多于對照組。以上研究結(jié)果充分證明了在力學(xué)刺激下，Runx2 基因會發(fā)生高表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞成骨分化，因此推測Runx2 基因可能為OPLL 的易感基因，在受到外界易感因素機(jī)械應(yīng)力持續(xù)影響后，被牽拉的后縱韌帶細(xì)胞內(nèi)Runx2 基因發(fā)生異常高表達(dá)，隨之向成骨分化，最終導(dǎo)致韌帶骨化發(fā)生，可認(rèn)為是遺傳和環(huán)境因素相互作用促使了OPLL 發(fā)生。這個猜想符合OPLL 多因素相互作用發(fā)生的臨床特點(diǎn)，但目前證明Runx2 基因是OPLL 易感基因的證據(jù)仍不足，這個猜想尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

3 miRNA 對OPLL 致病基因的潛在調(diào)控作用

miRNA 是新近發(fā)現(xiàn)的人體內(nèi)一類調(diào)控性非編碼小RNA，參與調(diào)控包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡等一系列生理進(jìn)程，在基因表達(dá)過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，其調(diào)節(jié)紊亂將導(dǎo)致疾病發(fā)生。其調(diào)控機(jī)制是通過結(jié)合mRNA 的3＇端非編碼序列，降解靶基因mRNA 或轉(zhuǎn)錄后抑制靶基因表達(dá)而發(fā)揮作用［25］。已有研究證實(shí)，miRNA 在骨組織中的調(diào)控作用主要效應(yīng)于成骨過程，且成骨調(diào)節(jié)可表現(xiàn)為促進(jìn)或抑制成骨的雙向作用，正常情況下兩者處于平衡狀態(tài)，若部分miRNA 表達(dá)異常，將促使成骨調(diào)節(jié)紊亂，正常細(xì)胞可能會發(fā)生骨化［26］。

在miRNA 表現(xiàn)為抑制成骨的研究中，miR-199a是第一個被發(fā)現(xiàn)的BMP-2 反應(yīng)型miRNA，它可以通過調(diào)節(jié)BMP 信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Smad1，來抑制早期軟骨細(xì)胞的分化［27］。Li 等［26］通過對BMP-2誘導(dǎo)的間充質(zhì)細(xì)胞骨形成過程中基因芯片的研究，發(fā)現(xiàn)有22 個miRNA 表達(dá)下調(diào)，其中miR-133 和miR-135 分別作用于Runx2 和Smad5 靶基因，故認(rèn)為是通過阻礙了BMP-2 成骨信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從而抑制骨形成。此外，體外細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，miR-204 能與Runx2 基因3＇端非編碼序列特異性結(jié)合，內(nèi)源性下調(diào)人骨髓多能干細(xì)胞中Runx2 表達(dá)，導(dǎo)致成骨分化過程受抑制［28］。

在miRNA 表現(xiàn)為促進(jìn)成骨的研究中，Zhang等［29］發(fā)現(xiàn)在成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)下，miR-20a 通過上調(diào)BMP/Runx2 信號促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化。研究顯示miR-29b 能調(diào)控膠原基因促進(jìn)合成Ⅰ型膠原，為成骨細(xì)胞分化成熟提供細(xì)胞外基質(zhì)，同時又可通過抑制TGFβ3 蛋白的翻譯來促進(jìn)Runx2的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化［30］;在另一研究中，利用基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，成骨培養(yǎng)基環(huán)境下培養(yǎng)的人脊柱韌帶細(xì)胞miRNA 表達(dá)與對照組有差異，并證實(shí)miR-29b 表達(dá)上調(diào)，認(rèn)為其可能促進(jìn)了脊柱韌帶成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化［31］，這說明脊柱韌帶異位骨化發(fā)生與miRNA 對易感基因成骨表達(dá)的異常調(diào)節(jié)有關(guān)。

盡管近年來對OPLL 的認(rèn)識不斷加深，但其具體發(fā)生機(jī)制仍然不清。隨著遺傳學(xué)和基因檢測手段的進(jìn)步，越來越多的OPLL 易感基因被發(fā)現(xiàn)。由于OPLL 具有多因素共同致病的特點(diǎn)，在易感基因致病的基礎(chǔ)上，必須考慮環(huán)境因素對易感基因的影響，如力學(xué)刺激，易感人群的后縱韌帶長期接觸這些環(huán)境易感因素，觸發(fā)了后縱韌帶細(xì)胞內(nèi)易感基因的異常表達(dá)，這個過程為成骨信號進(jìn)入細(xì)胞后，經(jīng)過一連串的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終使細(xì)胞向成骨方向異常分化，而在成骨信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，某些小RNA 起著必不可少的調(diào)節(jié)作用，如miRNA，若部分miRNA 表達(dá)異常，也會使易感基因成骨表達(dá)異常增強(qiáng)，可促使OPLL發(fā)生。由于OPLL 被看作是一類在特定環(huán)境(如持續(xù)力學(xué)刺激作用下)罹患的遺傳疾病，弄清楚易感基因和環(huán)境因素(如力學(xué)因素)在OPLL 發(fā)生過程中的關(guān)系，以及miRNA 在易感基因成骨異常表達(dá)中的潛在調(diào)控作用，可為將來從遺傳學(xué)角度認(rèn)識OPLL發(fā)生機(jī)制開辟道路，有助于更好地理解脊柱OPLL發(fā)生發(fā)展的自然史，為下一步研究和干預(yù)OPLL 發(fā)病奠定基礎(chǔ)。

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