人工放流4 齡中華鱘鹽度適應(yīng)過程中血清生化指標(biāo)的變化

楊吉平，陳立僑，劉健，李二超，鄭躍平，崔超，陳錦輝

(1.華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海200062;2.上海市長江口中華鱘自然保護(hù)區(qū)管理處，上海200092)

中華鱘Acipenser sinensis是中國的一級保護(hù)動物，其資源量連年下降，迫切需要采取措施加以保護(hù)。已有研究表明，人工放流是一種切實有效的資源增殖方式［1］，也被廣泛應(yīng)用于中華鱘等水生生物資源的保護(hù)中［2］。近年來，為了持續(xù)補(bǔ)充中華鱘資源，國內(nèi)多家科研院所放流了2 ～12 齡的中華鱘［3-4］。但是自然環(huán)境中7 ～10月齡的中華鱘幼魚需在長江口咸水區(qū)域進(jìn)行入海前的生理適應(yīng)，只有完成鹽度適應(yīng)過程后才能從長江口進(jìn)入大海生活［5-6］，2 ～12 齡的中華鱘在人工養(yǎng)殖過程中錯過了適應(yīng)鹽度的時間，在長江口區(qū)域一旦被放流將面臨每日鹽度變化高達(dá)10 的脅迫［6-7］。國外一些增殖放流鱘魚的經(jīng)驗表明，放流個體的規(guī)格越大，其攝食、逃避敵害的能力越強(qiáng)，有較高的放流成活率［8-9］，因此，對2 齡以上中華鱘的鹽度適應(yīng)性評價十分重要。目前對中華鱘鹽度適應(yīng)方面的研究主要有鹽度耐受能力［10］、行為變化［11］、組織與器官對鹽度的適應(yīng)［10-11］、離子轉(zhuǎn)運(yùn)與調(diào)控［7］和激素調(diào)節(jié)［11］等方面，對鹽度脅迫下中華鱘的血液生化指標(biāo)和營養(yǎng)物質(zhì)利用方面的研究仍較缺乏。本研究中，作者以4 齡中華鱘為研究對象，研究了在鹽度為5、10 急性脅迫下中華鱘血清生化指標(biāo)的變化，初步分析了鹽度脅迫情況下中華鱘的物質(zhì)代謝及能量利用過程，結(jié)果可為補(bǔ)充鱘魚的生化指標(biāo)和深入研究其滲透壓調(diào)節(jié)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用魚為15 尾體質(zhì)量為(18.05 ±2.16)kg的子一代4 齡健康中華鱘，由上海市長江口中華鱘自然保護(hù)區(qū)管理處提供。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗分為3組:淡水對照組、鹽度5和鹽度10 的試驗組。飼養(yǎng)池塘規(guī)格為8 m×4 m×1.6 m，有效水體容量50 m3(養(yǎng)殖密度為1.84 kg/m3)。池塘配備生物及物理過濾材料和水循環(huán)系統(tǒng)。養(yǎng)殖用水為經(jīng)曝氣、凈化處理的深井水。用淡水和專配海鹽調(diào)配成鹽度分別為5、10 的兩個鹽度處理組。試驗期間，水溫為(22 ±2)℃，溶解氧大于7 mg/L，pH 為8.0 ±0.5，氨氮含量小于0.1 mg/L，亞硝酸鹽含量小于0.02 mg/L。

試驗開始時將中華鱘轉(zhuǎn)入試驗池中，每個處理組放入5 尾中華鱘。血樣采集期間暫停投喂飼料。

1.2.2 血樣的采集和測定 試驗開始前隨機(jī)選取中華鱘5 尾，采集血樣，作為0 h 的血樣。試驗開始后6、12、24、48、96 h 采集血樣，從每個處理組取5 尾魚，每尾每次采集2 mL 血液。血樣采集過程如下:用抄網(wǎng)迅速將鱘魚撈至含有MS-222(90 mg/L)［12］的水槽中(1.2 m×0.8 m×0.6 m)進(jìn)行麻醉處理，待魚安定后立即從尾部血管采血，然后立即將鱘魚放回池塘中。血樣于室溫下靜置，待血液分層后，于10 ℃下以4 000 r/min 離心10 min，分離血清，將血清保存于-80 ℃冰箱中待測［13］。

生化指標(biāo)采用荷蘭威圖全自動生化分析儀SELECTRA_ E 進(jìn)行測定，質(zhì)控和測試試劑均為Randox 試劑，檢測項目(檢測方法)分別為總蛋白(TP，雙縮脲法)、白蛋白(ALB，溴甲酚綠法)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT，IFCC 速率法)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST，IFCC 速率法)、尿素(UREA，UV 酶法)、血糖(GLU，GOD - PAP 法)、甘油三酯(TG，GPO - PAP 法)、膽固醇(CHOL，CHOD - PAP法)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL - C，直接法)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C，直接法)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan's 檢驗法進(jìn)行組間多重比較，以P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度脅迫對中華鱘血清TP、ALB、ALT、AST、UREA 含量的影響

從圖1可見:4 齡中華鱘進(jìn)入鹽度為5 的環(huán)境后，與對照組相比，6 h 時魚血清ALT 含量顯著升高(P＜0.05);24 ～96 h 時血清UREA 含量較對照組和鹽度10 組顯著下降(P＜0.05);其他各采樣時間點各指標(biāo)均無明顯變化(P ＞0.05)。4 齡中華鱘進(jìn)入鹽度為10 的環(huán)境后，與對照組相比，6 h和12 h 時魚血清TP 含量顯著升高(P＜0.05)，而后開始下降，24 ～96 h 時無顯著性差異(P ＞0.05);6 h 時魚血清ALT 含量顯著升高(P＜0.05);96 h 時魚血清AST 含量顯著下降(P＜0.05);其他各采樣時間點各指標(biāo)均無明顯變化(P ＞0.05)。

2.2 鹽度脅迫對中華鱘血清GLU 含量的影響

從圖1可見:試驗至12 h 時，各組魚血清GLU含量升高，之后逐漸下降，并于48 h 時降到最低，此后略有回升;與對照組相比，12 h 時鹽度5和10組魚血清GLU 含量明顯升高(P＜0.05)，其他各采樣時間點均無明顯變化(P ＞0.05)。

2.3 鹽度脅迫對中華鱘血清TG、CHOL、HDL－C和LDL－C 含量的影響

試驗至12 h 時，各組魚血清TG 含量升高，之后開始下降，并于24 h 時降至最低，隨后保持相對平穩(wěn);24 h 時，各組魚血清總CHOL 含量降低，隨后保持平穩(wěn)(圖1)。

從圖1可見:4 齡中華鱘進(jìn)入鹽度為5 的環(huán)境后，與對照組相比，12 h 時魚血清HDL -C 含量顯著上升(P＜0.05);其他各采樣時間點各指標(biāo)均無明顯變化(P ＞0.05)。4 齡中華鱘進(jìn)入鹽度為10 的環(huán)境后，與對照組相比，12 h 時，血清TG、HDL-C 含量顯著上升(P＜0.05);24 h 時血清CHOL 含量顯著降低(P＜0.05);24 ～96 h 時血清HDL-C 含量顯著降低(P＜0.05);其他各采樣時間點各指標(biāo)均無明顯變化(P ＞0.05)。

3 討論

目前對鹽度脅迫下鱘魚的血液指標(biāo)變化和能量利用的研究僅見于短吻鱘Acipenser brevirostrum［14］，該研究發(fā)現(xiàn)，鹽度脅迫過程中短吻鱘幼魚的血漿蛋白質(zhì)、血糖與對照組差異并不顯著，且脂肪是重要的能量來源，這與本試驗的結(jié)果有所不同。本研究中，當(dāng)4 齡中華鱘進(jìn)入鹽度為10 的環(huán)境后，血清中TP、GLU、TG 的含量均先顯著升高，隨后逐漸恢復(fù)到至對照組水平。依據(jù)魚類的遷移過程，魚類的生活史可分為淡咸水洄游型、江海洄游型、咸淡水遷移型和純淡水生活型［15］，有別于短吻鱘的咸淡水遷移型，中華鱘屬于江海洄游型。一些學(xué)者對同屬于江海洄游型的大馬哈魚的研究表明，在入海遷移的早期，機(jī)體對糖原利用、脂肪動員活動會有所增強(qiáng)［16-18］，部分支持了本研究的結(jié)果。所以，不同的遷移類型可能是魚類鹽度脅迫適應(yīng)過程中，血液指標(biāo)變化和能量利用方式有所不同的主要原因之一。

圖1 鹽度脅迫對中華鱘血清TP、ALB、ALT、AST、UREA、GLU、TG、CHOL、HDL－C和LDL－C 含量的影響Fig.1 Effects of salinity stress on total protein，albumin，alanine aminotransferase，aspartate aminotransferase，urea，glucose，triglyceride，cholesterol，high－density lipoprotein cholesterol，and low－density lipoprotein cholesterol levels in serum of Chinese sturgeon

對血清中蛋白質(zhì)及其代謝的研究顯示，在鹽度為10 的條件下脅迫6 ～12 h 時，中華鱘機(jī)體蛋白質(zhì)合成增加，表現(xiàn)為脂蛋白含量和相關(guān)酶(如ALT)含量的升高。一些學(xué)者對施氏鱘Acipenser amur 鹽度馴化過程中血清TP、轉(zhuǎn)氨酶等變化的研究中也獲得了類似的結(jié)論［13］。血清中的蛋白質(zhì)主要為ALB、脂蛋白、酶等。ALB是血液膠體滲透壓的主要維持者［19-20］，不會輕易發(fā)生改變，本研究結(jié)果中也證實了此觀點;脂類需經(jīng)脂蛋白包裝后才能經(jīng)血液運(yùn)載至目標(biāo)組織或器官［21］，本研究中鹽度脅迫12 h 時魚血清TG和HDL-C 含量顯著上升，提示12 h 前機(jī)體的脂蛋白合成增加;酶等調(diào)節(jié)蛋白在機(jī)體代謝調(diào)節(jié)和能量利用過程中發(fā)揮著重要作用，如轉(zhuǎn)氨酶在氨基酸代謝和蛋白質(zhì)合成過程中發(fā)揮作用［21］。本研究中鹽度脅迫6 h 時魚血清ALT 含量顯著升高，提示在鹽度脅迫初期相關(guān)酶合成增多。一般情況下，血清中蛋白質(zhì)含量降低的原因主要為蛋白質(zhì)降解，蛋白質(zhì)降解后產(chǎn)生游離氨基酸，氨基酸在轉(zhuǎn)氨酶的作用下進(jìn)行氨基轉(zhuǎn)換或進(jìn)行脫氨基作用轉(zhuǎn)化生成氨或尿素［21］。但從本研究的測定結(jié)果來看，12 ～48 h 內(nèi)各采樣時間鹽度為10的組魚血清ALT、AST和UREA 含量均未發(fā)生顯著變化，表明在鹽度為10 的條件下脅迫12 h 后中華鱘機(jī)體可能未進(jìn)行額外的氨基轉(zhuǎn)換和脫氨基活動，而蛋白質(zhì)含量的降低是被用于生成某些游離氨基酸，一些學(xué)者對鱘魚進(jìn)行較高鹽度的急性脅迫時也發(fā)現(xiàn)，肌肉總游離氨基酸的含量會顯著上升［22］。目前對鹽度脅迫狀態(tài)下魚類游離氨基酸代謝的研究還不多，值得進(jìn)一步研究。此外，當(dāng)4 齡中華鱘進(jìn)入鹽度為5 的環(huán)境后，機(jī)體血清中6 h 時的ALT 含量和24 h 時的UREA 含量發(fā)生了顯著變化，推測4齡中華鱘在鹽度5 脅迫的適應(yīng)過程中，機(jī)體動員了部分蛋白質(zhì)來參與滲透壓調(diào)節(jié)，但對尿素含量發(fā)生變化的原因需要進(jìn)一步探討。

對血糖的檢測結(jié)果表明，在鹽度為5和10 的脅迫條件下，血糖含量的升高滯后于蛋白質(zhì)的變化，但其對低鹽度(5)脅迫也較為敏感，表現(xiàn)為魚體進(jìn)入鹽度為5 的環(huán)境12 h 后血糖顯著升高。表明在12 h 時機(jī)體調(diào)動了糖原的分解，導(dǎo)致血糖含量升高，隨后被機(jī)體所利用。魚類血糖含量主要受皮質(zhì)醇等激素調(diào)節(jié)［23］，有研究表明，在鹽度10脅迫下的中華鱘幼魚在3 ～12 h 時皮質(zhì)醇含量顯著升高［11］，推測鹽度脅迫下皮質(zhì)醇的分泌與中華鱘血糖含量的升高密切相關(guān)。由于腎臟的腎髓質(zhì)、血液中的血紅蛋白、腦及神經(jīng)系統(tǒng)等依靠血糖供能［21］，而魚類的腎臟等組織和器官與滲透壓調(diào)節(jié)關(guān)系密切［24］，血糖的升高可以為相關(guān)組織和器官生理代謝提供需要的能量。

脂肪是機(jī)體重要的能源物質(zhì)，脂肪通過血液運(yùn)輸至各個器官進(jìn)行代謝并為機(jī)體提供能量［21］。對短吻鱘的研究中發(fā)現(xiàn)，脂肪是鹽度脅迫過程中重要的能量來源［14］，本試驗中也獲得了相似的結(jié)果。對魚血清中脂類的研究顯示，在鹽度10 脅迫過程中，脂類滯后于蛋白質(zhì)發(fā)生作用，至12 h 時機(jī)體對脂肪的動員加強(qiáng)，高密度脂蛋白收集血液中膽固醇的活動加強(qiáng)，隨后脂類物質(zhì)被機(jī)體分解和利用。膽固醇是類固醇激素(如皮質(zhì)醇等)合成的前體［21］，由高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)轉(zhuǎn)運(yùn)，其中HDL 收集血液中的CHOL 形成HDL-C，在血液中與LDL 進(jìn)行交換，形成LDL -C，隨后運(yùn)輸至腎上腺、性腺等器官加以利用［21］。本試驗中，在鹽度為10 的條件脅迫下，魚血清中CHOL和HDL-C 含量的變化提示，12 h 之前血液中CHOL 有可能被收集并隨后運(yùn)輸至腎臟中用于合成皮質(zhì)醇。當(dāng)4 齡中華鱘進(jìn)入鹽度為5 的環(huán)境后，血清TG 含量變化不顯著，僅12 h 時血清HDL -C含量發(fā)生了顯著變化，推測在低鹽度(5)脅迫下，機(jī)體未直接動員脂肪參與滲透壓的調(diào)節(jié)，而HDL-C 含量的變化是其對低鹽度脅迫的一種生理響應(yīng)。

從急性鹽度脅迫對4 齡中華鱘的血液指標(biāo)和生理變化的影響來看，機(jī)體的蛋白質(zhì)可能優(yōu)先被動員并參與了適應(yīng)性調(diào)節(jié)，而血糖則是主要的能量提供者。在對鹽度(10)環(huán)境適應(yīng)的過程中，鱘魚的脂肪也是部分能量的提供者，膽固醇通過高密度脂蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用。綜上所述，在4 齡中華鱘對鹽度適應(yīng)的過程中，蛋白質(zhì)可能優(yōu)先于其他物質(zhì)被動員而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，糖和脂肪則是機(jī)體重要的能量來源。

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