耐甲氧西林金黃色葡萄球菌異質(zhì)性耐藥株檢測方法探討

于 農(nóng)，張 偉，陳建魁，宋世平，金 欣，左向華

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，越來越多的細(xì)菌出現(xiàn)耐藥，且耐藥水平也越來越高。近年來具有多重耐藥性的革蘭陽性菌已在世界各地流行，其中最重要的病原菌之一為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)。MRSA的形成是由于mecA基因編碼產(chǎn)生了一個變異的青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP2a)［1］，其耐藥基因呈均質(zhì)性和異質(zhì)性表達(dá)［2］，常規(guī)方法檢測均質(zhì)性表達(dá)的菌株不難，但對異質(zhì)性MRSA(H-MRSA)菌株的檢測尚無理想方法［2］。本文對H-MRSA的檢測方法進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院2011年10月—2012年10月臨床各種培養(yǎng)標(biāo)本中分離得到金黃色葡萄球菌共102株，均經(jīng)過凝固酶試驗(yàn)及API鑒定系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司)鑒定。質(zhì)控菌株:甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)ATCC29213和MRSA ATCC43300，均購自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 方法

1.2.1 乳膠凝集法檢測PBP2a:嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作(乳膠試劑盒由日本Deka-Seiken公司提供)，采用包被有抗PBP2a單克隆抗體的乳膠顆粒與生長于血平板上純金黃色葡萄球菌菌落進(jìn)行凝集試驗(yàn)。結(jié)果判斷:出現(xiàn)凝集現(xiàn)象為陽性(產(chǎn)生PBP2a即 MRSA)，無凝集為陰性(即 MSSA)。以ATCC29213為陰性對照，ATCC43300為陽性對照。

1.2.2 肉湯稀釋法檢測MRSA:采用肉湯稀釋法進(jìn)行頭孢西丁和苯唑西林最低抑菌濃度(MIC)試驗(yàn)，操作嚴(yán)格按美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。結(jié)果判斷:頭孢西丁MIC≥8μg/ml、苯唑西林 MIC≥4μg/ml為耐藥，頭孢西丁 MIC≤4 μg/ml、苯唑西林 MIC≤2 μg/ml為敏感［2］。以ATCC29213和ATCC43300分別作為敏感、耐藥質(zhì)控菌株。

1.3 菌群譜分析法檢測H-MRSA 采用菌群譜分析法［2］，實(shí)驗(yàn)藥物改為苯唑西林。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn):生長率比值與對照質(zhì)控菌株(ATCC43300)相等為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10．3軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用χ2檢驗(yàn)，α=0．05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 MRSA檢出率比較 頭孢西丁耐藥71株(69.6%)，其中PBP2a陽性70株(98.6%);苯唑西林耐藥 80株(78.4%)，其中 PBP2a陽性 70株(87.5%)。頭孢西丁耐藥菌株P(guān)BP2a檢出率明顯高于苯唑西林，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 2種方法檢出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌結(jié)果(n=102)

2.2 H-MRSA檢測結(jié)果 102株金黃色葡萄球菌中篩選出2株H-MRSA(22.2%)，均來自苯唑西林耐藥而頭孢西丁敏感的9株菌中，頭孢西丁耐藥菌株中未檢出。

3 討論

自1961年第1株MRSA在英國被發(fā)現(xiàn)［3］后，MRSA在全球迅速漫延，已成為醫(yī)院感染的重要致病菌。由于多重耐藥，MRSA引起的感染常難以治療，因此被稱為“超級細(xì)菌”。國內(nèi)外文獻(xiàn)報道，在金黃色葡萄球菌引起的感染中，MRSA占60% ～80%［4-6］，且逐年增高?？焖?、準(zhǔn)確地檢測MRSA對選用合適的抗生素具有重要意義。

MRSA的主要耐藥機(jī)制是由于mecA基因表達(dá)了PBP2a，耐藥性呈均質(zhì)性和異質(zhì)性表達(dá)。呈均質(zhì)性表達(dá)的MRSA采用常規(guī)方法即可檢出，但對HMRSA目前尚無理想檢出方法［2］。異質(zhì)性耐藥菌株被認(rèn)為是過渡表型［7］，體外藥敏試驗(yàn)通常表現(xiàn)為低水平耐藥甚至敏感而不易被檢出［8］，但在一定條件下，尤其是使用抗生素后很快便會發(fā)展成為耐藥菌株，臨床治療尤為棘手［7，9-10］。如果發(fā)生異質(zhì)性耐藥菌株的流行，感染菌株的處理勢必將變成嚴(yán)重問題，目前世界范圍內(nèi)尚未制定出一套規(guī)范方法來治療異質(zhì)性耐藥菌株的感染［11］，因此異質(zhì)性耐藥菌株的檢出對于控制感染及預(yù)防擴(kuò)散至關(guān)重要［11-12］。

基于PBP2a是MRSA耐藥的根本原因，本研究以乳膠凝集法檢測PBP2a結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，比較金黃色葡萄球菌對頭孢西丁與苯唑西林的敏感性，結(jié)果顯示，102株金黃色葡萄球菌中頭孢西丁耐藥菌株中PBP2a陽性率為98.6%，苯唑西林耐藥菌株中PBP2a陽性率為87.5%，頭孢西丁檢出MRSA的敏感性優(yōu)于苯唑西林。這一結(jié)果與凝固酶陰性葡萄球菌表現(xiàn)相似，而與CLSI中對MRSA二者的敏感性和特異性差別不大的結(jié)論［13］不一致。

菌群譜分析法是CLSI認(rèn)為鑒定萬古霉素異質(zhì)性耐藥金黃色葡萄球菌的金標(biāo)準(zhǔn)，本研究借鑒這一方法，將萬古霉素改為苯唑西林，苯唑西林濃度采用CLSI瓊脂稀釋法標(biāo)準(zhǔn)。用這一方法對102株實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行了H-MRSA檢測，從9株苯唑西林耐藥而頭孢西丁敏感的菌株當(dāng)中篩出了2株。由此認(rèn)為苯唑西林對H-MRSA的敏感性優(yōu)于頭孢西丁。

由于試驗(yàn)步驟繁瑣、流程長，且需手工操作，菌群譜分析法不易在臨床推廣使用，因此，臨床實(shí)驗(yàn)室對常規(guī)方法檢出的苯唑西林低水平耐藥株應(yīng)引起重視［14］，并提示臨床注意觀察和復(fù)檢，力爭盡早控制異質(zhì)性耐藥株感染。

［1］ 美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會．抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn) CLSI M100-S22［S］．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，29(增刊):70-78．

［2］ 美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會．需氧菌的稀釋法抗菌藥物敏感性試驗(yàn)CLSI M07-A9［S］．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，29(增刊):27-28．

［3］ Jevons M P．Celbenin-resistant staphylococci［J］．B Med J，1961，242:124-125．

［4］ Hiramatsu K，Cui L，Kuroda M，et al．The emergence and evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］．Trends Microbiol，2001，9(10):486-493．

［5］ 黃輝，安如俊，周建黨．移植患者呼吸道金黃色葡萄球菌感染的分子流行病學(xué)［J］．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2008，18(2):189-191．

［6］ Dumitrescu O，Dauwalder O，Boisset S，et al．Staphylococcus aureus resistance to antibiotics:key points in 2010［J］．Med Sci，2011，26(11):943-949．

［7］ 侯琦，馬筱玲．細(xì)菌的異質(zhì)性耐藥［J］．臨床輸血與檢驗(yàn)，2003，5(3):238-239．

［8］ Van Hal SJ，Wehrhahn M C，Barbagiannakos T，et al．Performance of various testing methodologies for detection of heteroresistant vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus in bloodstream isolates［J］．J Clin Microbiol，2011，49(4):1489-1494．

［9］ Han JH，Edelstein PH，Lautenbach E．Reduced vancomycin susceptibility and staphylococcal cassette chromosome mec(SCCmec)type distribution in methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteraemia［J］．J Antimicrob Chemother，2012，67(10):2346-2349．

［10］張紅旭，陳良安．異質(zhì)性萬古霉素中介的金黃色葡萄球菌耐藥機(jī)制及臨床意義［J］．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2012，22(17):3923-3925．

［11］張晨，金鳳玲，朱海平．異質(zhì)性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌的分離及檢測方法的建立［J］．國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，33(13):1551-1553．

［12］Pitz A M，Yu F，Hermsen E D，et al．Vancomycin susceptibility trends and prevalence of heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus in clinical methicillin-resistant S．a(chǎn)ureus isolates［J］．JClin Microbiol，2011，49(1):269-274．

［13］美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會．抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)CLSI M02-A11［S］．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，29(增刊):19．

［14］ Howden B P，Davies JK，Johnson P D，et al．Reduced vancomycin susceptibility in Staphylococcus aureus，including vancomycin-intermediate and heterogeneous vancomycin-intermediate strains:resistance mechanisms，laboratory detection，and clinical implications［J］．Clin Microbiol Rev，2010，23(1):99-139．