Otoferlin蛋白與聽毛細(xì)胞突觸傳導(dǎo)＊

郭旭堯 綜述 袁偉 張學(xué)淵 審校

在哺乳動(dòng)物中，耳蝸基底膜突觸囊泡是聽覺感知的重要部分，它通過纖毛細(xì)胞機(jī)械傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)Ca2＋通道的Ca2＋內(nèi)流從而刺激遞質(zhì)釋放傳入感覺中樞。為了維持適當(dāng)?shù)腃a2＋濃度，體內(nèi)系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生多種多樣的功能蛋白：比如感覺神經(jīng)系統(tǒng)中的Ca2＋“傳感器”—海馬鈣蛋白（hippocalcin）、視錐蛋白（visinin）和恢復(fù)蛋白（recoverin）。近年來，在耳蝸聽毛細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)了一種新的蛋白質(zhì)—Otoferlin，其分子量約230kDa，可能在聽毛細(xì)胞中充當(dāng)著Ca2＋“傳感器”的角色，并且對(duì)維持正常聽力起重要作用。本文就Otoferlin蛋白在耳蝸聽毛細(xì)胞突觸囊泡中的功能進(jìn)行綜述。

1 Otoferlin蛋白的結(jié)構(gòu)

Otoferlin蛋白是由OTOF 基因最長(zhǎng)亞型編碼的一種特殊蛋白質(zhì)，存在6個(gè)Ca2＋結(jié)合區(qū)域—C（2）區(qū)域，其中4個(gè)含有完整的5個(gè)天冬氨酸殘基，可以和Ca2＋結(jié)合；這個(gè)最長(zhǎng)亞型包含48個(gè)外顯子，其中外顯子1未被編碼，編碼長(zhǎng)度為1 997個(gè)氨基酸的類ferlin蛋白Otoferlin［1～3］；并且它的Ca2＋結(jié)合區(qū)域還可以與胞漿磷脂酶A2、突觸結(jié)合蛋白I（synaptotagmin I）、Ras相關(guān)的GTP 結(jié)合蛋白等結(jié)合，在細(xì)胞膜運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)及神經(jīng)遞質(zhì)釋放等方面起著重要作用［4］。OTOF 基因家族有兩個(gè)亞型：一種含有DysF，一種缺失DysF。無脊椎動(dòng)物通常只有兩個(gè)OTOF基因（1個(gè)含有DysF和1個(gè)缺失DysF），大多數(shù)的脊椎動(dòng)物含有6個(gè)OTOF 基因（3個(gè)含有DysF和3個(gè)缺失DysF）。幾乎所有的Otoferlin蛋白都含有1個(gè)N－terminalC2－FerI－C2“三明治”樣結(jié)構(gòu)、1個(gè)FerB基因序列和2個(gè)毗鄰的C－末端C（2）跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域［C（2）E 和C（2）F］，它們是保持Otoferlin蛋白功能的基本結(jié)構(gòu)；而DysF、C（2）E和FerA 是可以選擇的，屬于OTOF 基因的結(jié)構(gòu)拓展域，它們?nèi)笔б材鼙３諳toferlin蛋白的基本功能［5］。通過以甘氨酸、天冬氨酸代替Otoferlin蛋白Ca2＋結(jié)合區(qū)域的C（2）F結(jié)構(gòu)域試驗(yàn)，證明Otoferlin蛋白的C（2）F是Ca2＋結(jié)合至關(guān)重要的結(jié)構(gòu)域，對(duì)帶狀突觸囊泡的融合起至關(guān)重要的作用［6］。重組蛋白質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)Otoferlin蛋白6個(gè)C（2）區(qū)域中的5個(gè)能感受Ca2＋，在膜表面親和力高達(dá)7倍，其解離常數(shù)達(dá)到13～25uM；重組膜融合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這5個(gè)C（2）區(qū)域能刺激激活Ca2＋依賴性的膜融合，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)C（2）C 區(qū)域不能結(jié)合Ca2＋，不能刺激膜融合［7］。在1.95－A 分辨率下發(fā)現(xiàn)Otoferlin蛋白的C（2）鈣離子結(jié)合區(qū)域N 末端晶體結(jié)構(gòu)C2－A，這個(gè)C（2）區(qū)域擁有完整的8個(gè)β－折疊，并且與突觸結(jié)合蛋白、蛋白激酶C 亞型和磷脂酶類序列有點(diǎn)類似，而且它的頂部環(huán)狀結(jié)構(gòu)相比Otoferlin的其他C（2）區(qū)域顯著縮短。C2－A 這個(gè)帶正電荷的C（2）區(qū)域與其它典型的C（2）區(qū)域頂部圍繞的帶有負(fù)電荷的“頸”狀隆起不一樣，C2－A 這個(gè)C（2）區(qū)域不能結(jié)合Ca2＋，而且也不能結(jié)合磷脂膜，因此，其它沒有帶正電荷的β－折疊C（2）區(qū)域才能結(jié)合磷脂酰肌醇－4，5－二磷酸［8］。

2 Otoferlin蛋白的表達(dá)

利用免疫組織化學(xué)法和原位雜交的方法發(fā)現(xiàn)Otoferlin蛋白在Wistar大鼠的耳蝸、前庭、耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)、前庭神經(jīng)核、小腦、海馬回和睪丸均有表達(dá)［9］。在未成熟的小鼠耳蝸中Otoferlin蛋白主要表達(dá)在內(nèi)毛細(xì)胞，在外毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞著色較淺，在球囊、橢圓囊、半規(guī)管的神經(jīng)纖維及前庭神經(jīng)元I型細(xì)胞上也有表達(dá)；但是Otoferlin蛋白在成年小鼠耳蝸中僅在內(nèi)毛細(xì)胞高度表達(dá)，而支持細(xì)胞上沒有表達(dá)，并且集中表達(dá)于內(nèi)毛細(xì)胞基底膜外側(cè)，而內(nèi)毛細(xì)胞也正是在此處與傳入神經(jīng)元的樹突形成獨(dú)特的帶狀突觸進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，同時(shí)利用免疫組化染色和膠體金技術(shù)在小鼠耳蝸切片標(biāo)記中發(fā)現(xiàn)，55%的Otoferlin顆粒位于帶狀突觸附近，其中21%位于突觸前膜上，4%位于突觸部位附近胞質(zhì)中［10］。在Otoferlin蛋白中鑒定出一種單克隆抗體HCS－1（hair cell soma－1），其在帶狀突觸免疫染色不集中，推測(cè)Otoferlin蛋白除了在聽毛細(xì)胞傳入突觸囊泡胞吐釋放發(fā)揮作用外可能還有其他的功能，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Otoferlin蛋白主要分布在內(nèi)毛細(xì)胞基底膜外側(cè)和帶狀突觸囊泡胞漿中，它緊密附著在基底膜上，是一種不溶性鈣鹽濃縮物［11］。

3 Otoferlin蛋白在聽毛細(xì)胞突觸傳導(dǎo)中的功能

Otoferlin蛋白在耳蝸的表達(dá)與內(nèi)毛細(xì)胞傳入神經(jīng)突觸之間有顯著的關(guān)聯(lián)，這意味著Otoferlin蛋白可能是內(nèi)毛細(xì)胞突觸前膜結(jié)構(gòu)的重要組成部分，因此推測(cè)Otoferlin蛋白是一種含有Ca2＋結(jié)合區(qū)域的跨膜功能蛋白，充當(dāng)著Ca2＋“傳感器”的角色，在內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸前膜融合，從而對(duì)內(nèi)毛細(xì)胞傳入突觸囊泡的分泌發(fā)揮著重要作用［12］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OTOF基因敲除純合子小鼠表現(xiàn)為極重度聾，聽性腦干反應(yīng)（ABR）不能引出，其內(nèi)毛細(xì)胞與傳入神經(jīng)元所形成的帶狀突觸形態(tài)正常，Ca2＋的流通也正常，但是突觸囊泡的分泌作用卻完全停止［10］。關(guān)于它是如何在帶狀突觸前膜融合的，Roberts［13］提出如下假說：Otoferlin蛋白開始主要集中在突觸帶周圍的突觸囊泡胞漿中，Ca2＋內(nèi)流與其結(jié)合，定向釋放到突觸前膜的結(jié)合位點(diǎn)，激活預(yù)先固定在結(jié)合位點(diǎn)的SNARE蛋白復(fù)合體（syntaxin－1A 和SNAP－25），然后促使突觸囊泡與質(zhì)膜緊密融合并釋放神經(jīng)遞質(zhì)。

聽毛細(xì)胞突觸結(jié)合蛋白復(fù)合體中有兩種主要SNARE靶蛋白：syntaxin－1A 和SNAP－25，他們與Otoferlin蛋白相互作用；同時(shí)發(fā)現(xiàn)Otoferlin的Ca2＋結(jié)合區(qū)域C（2）F與C（2）D 是Ca2＋結(jié)合最重要結(jié)構(gòu)域，SNARE 蛋白復(fù)合體主要結(jié)合在C（2）F（P1825A）結(jié)構(gòu)域［14］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過突變Ca2＋結(jié)合區(qū)域改變Otoferlin結(jié)合syntaxin－1A 和SNAP－25能力，改變Cav1.3通道Ca2＋流通效率，可以間接調(diào)節(jié)Otoferlin對(duì)突觸囊泡分泌釋放而影響內(nèi)毛細(xì)胞的功能。為了解耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞囊泡分泌過程中Otoferlin與突觸結(jié)合蛋白之間的關(guān)系，Beurg等［15］通過測(cè)量出生4 天的鼠內(nèi)毛細(xì)胞電容，發(fā)現(xiàn)其是Ca2＋依賴性分泌，Otoferlin可能是構(gòu)成Ca2＋依賴性膜融合的基礎(chǔ)功能蛋白，是增加內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸囊泡融合概率和同步性的必要蛋白；早期分泌物中檢測(cè)到Sty1、Sty2、Sty7幾種突觸結(jié)合蛋白，Sty1和Sty2這兩種中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸中常見的Ca2＋“傳感器”在成熟內(nèi)毛細(xì)胞中沒有表達(dá)［15］。通過比較內(nèi)毛細(xì)胞、腎上腺嗜鉻細(xì)胞和海馬神經(jīng)元三種細(xì)胞分泌模型系統(tǒng)中Otoferlin和Sty1的功能發(fā)現(xiàn)，將Sty1基因異位表達(dá)于OTOF 敲除小鼠培養(yǎng)的胚胎內(nèi)耳器官中，沒有激活它的Ca2＋依賴性分泌，Otoferlin蛋白過度表達(dá)于敲除Sty1的嗜鉻細(xì)胞和海馬神經(jīng)元，也沒有恢復(fù)局部分泌，但是增強(qiáng)了海馬神經(jīng)元的遞質(zhì)釋放［16］。之后Pangrsic等［17］提出假說：Otoferlin蛋白與快相釋放囊泡（RRP）補(bǔ)充融合關(guān)系密切。他們?cè)贒FNB9耳聾鼠的模型中發(fā)現(xiàn)，用天冬氨酸和甘氨酸突變代替Otoferlin 蛋白C（2）F 區(qū)域，評(píng)估其RRP、Ca2＋信號(hào)和囊泡的功能，加入突觸后電流的大小變量和波峰值測(cè)試，發(fā)現(xiàn)突變型小鼠比野生型小鼠快相釋放囊泡RRP 恢復(fù)補(bǔ)充減少且速度緩慢。

然而并不只有syntaxin－1A、2A 和SNAP－25是與Otoferlin相互作用的蛋白質(zhì)，有研究顯示除了突觸結(jié)合蛋白－1和突觸結(jié)合蛋白－2這兩種經(jīng)典的突觸融合蛋白外，通過酵母菌雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一種新的與Otoferlin 有關(guān)的蛋白myosinVI，通過免疫共沉淀法發(fā)現(xiàn)內(nèi)毛細(xì)胞基底膜外側(cè)Otoferlin和myosinVI兩種相互作用蛋白，通過比較兩種蛋白質(zhì)的突變體發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白質(zhì)對(duì)突觸成熟起到了互補(bǔ)作用：①內(nèi)毛細(xì)胞Otoferlin突變的小鼠其Cav1.3通道Ca2＋生物電活動(dòng)嚴(yán)重減退，CtBP2／RIBEYE標(biāo)記的突觸囊泡分泌作用嚴(yán)重下降；②內(nèi)毛細(xì)胞myosinVI突變的小鼠其耳蝸頂回毛細(xì)胞區(qū)域的膜BK＋通道生物電活動(dòng)衰退，Ca2＋依賴性分泌效率下降；③內(nèi)毛細(xì)胞兩種蛋白突變的小鼠顯示出標(biāo)記的突觸蛋白數(shù)量減少和形態(tài)改變［18，19］。

Engel等［20］對(duì)外毛細(xì)胞Ca2＋相關(guān)通道功能研究發(fā)現(xiàn)，耳蝸低頻區(qū)外毛細(xì)胞Ca2＋通道在敲除Otoferlin 蛋白后的反應(yīng)比高頻區(qū)外毛細(xì)胞敏感。Beurg等［21］通過研究動(dòng)物未成熟外毛細(xì)胞的Ca2＋通道和Otoferlin蛋白相關(guān)的分泌作用發(fā)現(xiàn)，新生小鼠敲除OTOF 基因后，其不成熟的外毛細(xì)胞Ca2＋通道生物電活動(dòng)正常，但是突觸囊泡的分泌作用卻完全停止。Johnso等［22］利用Ca2＋試劑盒和全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，精確檢測(cè)未成熟沙鼠毛細(xì)胞膜電容變化，間接地反映突觸囊泡分泌作用，提出Otoferlin蛋白不論是在內(nèi)毛細(xì)胞的高Ca2＋依賴性的突觸囊泡分泌作用，還是在與外毛細(xì)胞Ca2＋的線性關(guān)系上，都是作為耳蝸毛細(xì)胞Ca2＋“傳感器”而影響著聽神經(jīng)帶狀突觸囊泡的膜融合和分泌釋放。因此，Otoferlin蛋白不僅在毛細(xì)胞Ca2＋通道活動(dòng)中起到至關(guān)重要的作用，可能同樣作用于未成熟的外毛細(xì)胞Ca2＋通道。

Brandt等［23］的研究表明甲狀腺激素可以調(diào)控未成熟毛細(xì)胞Ca2＋和K＋通道活動(dòng)，他們質(zhì)疑Otoferlin蛋白是毛細(xì)胞突觸囊泡分泌作用的必需蛋白質(zhì)。Schuowatzki等［24］提出OTOF 基因敲除的動(dòng)物，突觸活動(dòng)仍然存在，只是膜電容測(cè)量顯示突觸囊泡融合減少。而且，還發(fā)現(xiàn)Otoferlin不僅通過結(jié)合SNARE蛋白復(fù)合體和Ca2＋的方式參與帶狀突觸囊泡的融合及神經(jīng)遞質(zhì)釋放，也可以通過和Rab8b鳥苷酸三磷酸酶共同作用參與跨高爾基體的運(yùn)輸過程［25］。在小鼠的一些非神經(jīng)組織內(nèi)也見到了Otoferlin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，說明Otoferlin蛋白可能并不是唯一與Ca2＋通道活動(dòng)相關(guān)的蛋白質(zhì)，可能也參與了其它一些細(xì)胞的運(yùn)輸過程［1］。

4 Otoferlin蛋白的研究前景

雖然目前關(guān)于Otoferlin蛋白的結(jié)構(gòu)、表達(dá)和功能研究取得了一定的進(jìn)展，然而目前關(guān)于聽毛細(xì)胞中Otoferlin蛋白作為Ca2＋“傳感器”控制Ca2＋依賴性的突觸囊泡分泌釋放還存在幾個(gè)疑問：①免疫組織化學(xué)和mRNA 檢測(cè)指出Otoferlin廣泛分布于中樞神經(jīng)元和神經(jīng)纖維中［9］，其在這些位置的作用機(jī)理不清；②部分沒有Otoferlin表達(dá)的哺乳動(dòng)物模型也有胞吐作用［23］，為什么？③耳蝸不同部位、不同年齡導(dǎo)致Ca2＋依賴性胞吐敏感性改變，但Otoferlin蛋白的分泌沒有明顯變化［4］；④Otoferlin蛋白影響耳蝸聽毛細(xì)胞傳入突觸囊泡胞吐釋放，但是在前庭毛細(xì)胞是否有作用沒有進(jìn)一步研究［10，24］；缺乏Otoferlin蛋白的形態(tài)學(xué)和定量研究。因此，Otoferlin蛋白表達(dá)的影響還需要不斷的深入研究；同時(shí)，Otoferlin蛋白除了作為Ca2＋“傳感器”外，是否還存在其它的生理功能，都需要進(jìn)一步的研究。

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