紫外分光光度法測定復(fù)方氫醌脂質(zhì)體含量和包封率＊

劉 娟，廖 娟，李 遠(yuǎn)，金 梅（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院，重慶 402160）

復(fù)方氫醌制劑結(jié)合了氫醌能降低皮膚色素沉著和維甲酸能消除皮膚細(xì)小的皺紋的特點，主要用于治療黃褐斑、雀斑及炎癥后色素沉著斑等[1]。然而，氫醌作為光感性物質(zhì)，性質(zhì)極不穩(wěn)定，易氧化變色而失效，維甲酸則刺激性比較大[2－3]。筆者制備了復(fù)方氫醌脂質(zhì)體，旨在對提高氫醌抗氧化能力和降低維甲酸的刺激性，但目前國內(nèi)外尚無可用于復(fù)方氫醌脂質(zhì)體體外分析的方法[4－6]。本研究擬建立其體外藥物分析方法，為進(jìn)一步分析其體外藥物釋放行為奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 CP224電子天平（上海奧豪斯），RE－52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮），SHB－Ш循環(huán)水式多用真空泵（上海瑞智），Varioskan Flash酶標(biāo)儀（美國Thermo），Purelab classic純水器（法國Elga），SB－5200DTDN超聲波清洗機(jī)（寧波新芝），Neofuge 15R離心機(jī)（香港力康），GL－88B旋渦混合器（海門其林貝爾）。復(fù)方氫醌脂質(zhì)體（氫醌1 200μg／mL，維甲酸200 μg／mL）和空白脂質(zhì)體由本院中心實驗室自制。氫醌（成都科龍）、維甲酸（上海安耐吉）、硫酸氫鈉（天津大茂）、無水乙醇（美國Amresco）、Ⅱ－S型磷脂（美國Sigma）、膽固醇（純度大于98%，上海生工生物）均為分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 空白脂質(zhì)體和復(fù)方氫醌脂質(zhì)體的制備 聯(lián)合采用薄膜分散法和超聲法制備空白脂質(zhì)體和復(fù)方氫醌脂質(zhì)體。具體操作如下：稱取處方量磷脂和膽固醇置于茄形瓶中，加入適量氯仿，待膜材溶解完全后，快速加入氫醌、維甲酸和硫酸氫鈉的無水乙醇溶液后混勻，50℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，去除有機(jī)溶劑，制備均勻干膜；加入50℃預(yù)熱的0.2mol／L磷酸緩沖液（pH5.7）50mL，旋轉(zhuǎn)洗膜，超聲30min，制備復(fù)方氫醌脂質(zhì)體懸液，4℃放置備用。空白脂質(zhì)體制備方法同上，加入的無水乙醇溶液不含氫醌和維甲酸。

1.2.2 方法專屬性 按處方量稱取維甲酸、氫醌和空白脂質(zhì)體，無水乙醇完全溶解，分別進(jìn)行紫外掃描。

1.2.3 線性范圍 按處方量稱取維甲酸和氫醌，無水乙醇完全溶解，制備200μg／mL維甲酸和1 200μg／mL氫醌混合溶液，分別用無水乙醇稀釋40、20、10、8、5倍，每一濃度為3個樣本，檢測波長294、340nm處吸收峰，并對氫醌和維甲酸濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 精密度實驗 取上述40、20、10倍稀釋的維甲酸和氫醌混合溶液，以高、中、低3個濃度水平的混合樣品進(jìn)行檢測。每一濃度制備5個樣品，1d內(nèi)連續(xù)測定5次計算日內(nèi)精密度；每日測定1次，連續(xù)測定5d，計算日間精密度。將日內(nèi)精密度代入回歸方程，計算測得量，以測得量與加入量之比計算相對回收率。

1.2.5 回收率實驗 分別在空白脂質(zhì)體中加入維甲酸，使其濃度分別為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50mg／mL，并按處方比例加入氫醌，空白脂質(zhì)體定容至1mL，振蕩混勻。取200μL破乳，稀釋后分別在294、340nm處測定絕對回收率。

1.2.6 氫醌與維甲酸濃度檢測 吸取復(fù)方氫醌脂質(zhì)體0.2 mL至試管中，0.8mL氯仿破乳，加入0.8mL無水乙醇稀釋，搖勻，取0.2mL稀釋5倍后作為供試液，分別測定294、340 nm處吸收峰。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算氫醌和維甲酸濃度。

1.2.7 脂質(zhì)體包封率 取1mL脂質(zhì)體懸液，4℃條件下12 000r／min離心20min，取上清液0.2mL，破乳稀釋后測定包封率，包封率（%）＝（C總－C上清液）／C總×100%[7]。

2 結(jié) 果

2.1 方法專屬性 維甲酸和氫醌分別在波長340、294nm處有吸收；在294nm處，空白脂質(zhì)體有一定吸收，對檢測專屬性有稍許影響，故檢測脂質(zhì)體氫醌含量時，須扣除空白脂質(zhì)體在294nm的吸收；維甲酸在294nm處吸收小，對氫醌的干擾較小。氫醌和空白脂質(zhì)體在維甲酸檢測波長340nm處吸收較小，基本無干擾。見圖1。

2.2 線性范圍 維甲酸濃度5～40μg／mL，以340nm處光密度值（OD值）為縱坐標(biāo)，以維甲酸濃度為橫坐標(biāo)，得到直線回歸方程：Y＝0.016 4X＋0.054（r2＝0.99，n＝5）。氫醌濃度30～240μg／mL，以290nm處OD值為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，得到直線回歸方程：Y＝0.117 9X＋0.158 1（r2＝0.99，n＝5）。

2.3 精密度和回收率 維甲酸、氫醌絕對回收率分別為96.6%[n＝5，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）4.7%]和93.3%（n＝5，RSD4.9%）；相對回收率均值為80.95%。見表1。

圖1 維甲酸、氫醌及空白脂質(zhì)體紫外掃描圖

表1 日內(nèi)精密度、日間精密度及方法回收率（n＝5）

2.4 脂質(zhì)體濃度與包封率 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算氫醌和維甲酸的濃度分別為91.7%（RSD0.022）、90.0%（RSD0.019）。制備2個批次脂質(zhì)體，氫醌包封率分別48.2%、48.9%，維甲酸包封率為77.1%、78.4%。

3 討 論

氫醌是顏面皮膚色素沉著病局部用藥的首選藥物，由于為對苯二酚結(jié)構(gòu)，性質(zhì)極不穩(wěn)定，易氧化變色而失效，在光照及堿性條件下尤甚，故本實驗選無水乙醇作溶媒，棕色容量瓶做容器，以減少誤差。由于無水乙醇易揮發(fā)，所以在測定紫外吸收時，比色皿均加蓋，以減少由于溶媒揮發(fā)而造成誤差。

本研究制備的復(fù)方氫醌脂質(zhì)體結(jié)合了氫醌能降低皮膚色素沉著和維甲酸能消除皮膚細(xì)小皺紋的優(yōu)勢。利用脂質(zhì)體作為藥物載體，可增加藥物溶出度，增強(qiáng)藥物進(jìn)入角質(zhì)層或表皮類脂內(nèi)的作用，增加藥物在皮膚局部的積累，緩慢持續(xù)釋放藥物，有利于保持局部藥物濃度[8－9]。

復(fù)方氫醌脂質(zhì)體中的氫醌、維甲酸在紫外區(qū)都有吸收，故本研究將氫醌、維甲酸與空白脂質(zhì)體單獨掃描，結(jié)果顯示按處方量用無水乙醇溶解的維甲酸和氫醌檢測波長分別為294、340nm。在294nm的氫醌檢測波長處，維甲酸吸收較小，對氫醌的干擾較小，但空白脂質(zhì)體在該波長下有一定吸收，故在實際檢測中，本研究用空白脂質(zhì)體作對照，以扣除空白脂質(zhì)體對氫醌檢測的影響，平均回收率為86.76%。氫醌和空白脂質(zhì)體在340nm的維甲酸檢測波長處吸收較小，基本無干擾，因此維甲酸仍在340nm波長處檢測。用紫外分光光度法測定復(fù)方氫醌脂質(zhì)體濃度和包封率結(jié)果準(zhǔn)確可靠，簡單易行，可推廣。

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