BCG對鼠RAW264.7巨噬細胞miR-203、miR-142-3p、miR-21表達的影響①

張兆波 魏 軍 湯建中 趙志軍 張一琳 張瑞芹 徐廣賢 （寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗學(xué)院，銀川 750004）

BCG對鼠RAW264.7巨噬細胞miR-203、miR-142-3p、miR-21表達的影響①

張兆波 魏 軍 湯建中 趙志軍②張一琳 張瑞芹 徐廣賢 （寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗學(xué)院，銀川 750004）

目的:檢測卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）刺激巨噬細胞后miR-203、miR-142-3p、miR-21表達量的變化，為研究microRNA（miRNA）在巨噬細胞抗結(jié)核分枝桿菌免疫應(yīng)答中的調(diào)控作用提供依據(jù)。方法:利用濃度為1.0×107m l－1的BCG刺激培養(yǎng)的小鼠RAW264.7細胞，分別在4、8、12、24小時提取細胞small RNA，并利用相應(yīng)的莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時構(gòu)建成熟miR-203、miR-142-3p、miR-21的T載體，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用Real-Time PCR檢測miR-203、miR-142-3p、miR-21的表達量。結(jié)果:BCG作用 RAW264.7細胞4、8、12、24小時后，miR-21表達顯著性上調(diào)（10倍以上，P＜0.05），miR-142-3p表達顯著性下調(diào)（20倍以上，P ＜0.05），miR-203在4、8、12小時表達下調(diào)（3倍以上，P ＜0.05），24小時后表達上調(diào)（2倍以上，P＜0.05）。結(jié)論:BCG刺激RAW264.7巨噬細胞后，miR-203、miR-142-3p、miR-21的表達發(fā)生顯著性變化，說明這些miRNA可能通過調(diào)控免疫相關(guān)基因在巨噬細胞抗結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。

miRNA;BCG;real-time PCR

microRNA是一種約21～25核苷酸長度的單鏈 小分子RNA。它廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，成熟的miRNA通過和其靶基因3'非翻譯區(qū)結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC），特異性降解其靶mRNA或阻礙其靶mRNA的翻譯［1，2］。當(dāng)機體受到微生物感染時，miRNA可通過靶向免疫系統(tǒng)中關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達，從而在多個環(huán)節(jié)上參與調(diào)控機體固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。

許多miRNA被認(rèn)為與固有免疫應(yīng)答調(diào)控密切相關(guān)，如 miR-155、miR-146a、miR-142-3p、miR-21、miR-203等。Sun等［3］發(fā)現(xiàn) miR-142-3p可靶向作用于樹突細胞中IL-6的表達來調(diào)節(jié)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的死亡。說明了miR-142-3p在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的樹突狀細胞免疫耐受過程中起著非常重要的作用。另外在研究白念珠菌刺激的樹突狀細胞模型中發(fā)現(xiàn)，miR-203可以靶向抑制TLR4的表達，從而負(fù)向調(diào)節(jié)IL-6和TNF-α的產(chǎn)生。LPS可以通過激活Myd88和NF-κB依賴性途徑促進miR-21表達持續(xù)增高，上調(diào)miR-21的表達后可以上調(diào)IL-10的表達，抑制PDCD4的表達，miR-21通過作用于PDCD4發(fā)揮對TLR4通路的負(fù)向調(diào)控作用，從而負(fù)向調(diào)控固有免疫的強度［4］。結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細胞后，巨噬細胞可以通過其表面的模式識別受體介導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌進入巨噬細胞，引起免疫應(yīng)答反應(yīng)，其中巨噬細胞的TLRs與結(jié)核分枝桿菌的關(guān)系研究較多。TLRs通過選擇性地識別病原體中病原相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）的保守結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)對入侵病原體的早期識別，激活天然免疫。結(jié)核分枝桿菌的PAMPs與TLRs相互作用可同時激活TLR2和TLR4，它們都最終導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄以及相應(yīng)免疫基因的活化，釋放前炎癥因子及輔助刺激分子調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，從而為機體提供免疫保護作用。TLRs的激活需要許多調(diào)控機制來維持其平衡以利于機體的免疫保護作用。目前研究表明，miRNA在TLRs通路中可以起到負(fù)向調(diào)控作用，如在粒細胞生成過程中可能由于增加了miR-223的表達量，TLR3的mRNA表達處于低水平。人牙齦角質(zhì)形成細胞中miR-105對TLR-2蛋白的翻譯起著負(fù)調(diào)節(jié)作用。在體外培養(yǎng)的人膽道上皮細胞中l(wèi)et-7通過轉(zhuǎn)錄后抑制來調(diào)控TLR4表達。miR-146a可通過抑制TRAF-6和IRAK-1表達，反饋抑制TLRs信號通路，抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，防止炎癥擴散［5-9］。BCG刺激巨噬細胞后 miR-203、miR-142-3p、miR-21的表達尚不清楚，我們的前期研究表明，miR-203可以靶向作用Myd88負(fù)向調(diào)控TLR信號通路（文章尚未發(fā)表），而且通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-203、miR-142-3p、miR-21可以調(diào)控許多免疫相關(guān)基因（如 IRAK-1、IL-6、TLR-4、RAC-1 等），這些 miRNA在巨噬細胞抗結(jié)核分枝桿菌過程中的調(diào)控作用未見報道。因此，我們建立牛結(jié)核分枝桿菌卡介苗毒株（BCG）與小鼠RAW264.7巨噬細胞的相互作用模型，通過 Real time-PCR檢測 miR-203、miR-142-3p、miR-21分子的表達量，為進一步研究miR-203、miR-142-3p、miR-21在BCG誘導(dǎo)的巨噬細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)中作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料與試劑 TA Cloning?試劑盒（Invitrogen公司，美國）;質(zhì)粒小提試劑盒（愛思進生物技術(shù)有限公司，杭州）;RNAiso for Small RNA，SYBR?Premix Ex Taq TM II（Perfect Real Time），MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa公司，大連）;RNase inhibitors（Invitrogen公司，美國）;胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國）;引物合成與DNA測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞為本室保存。

1.1.2 引物設(shè)計與合成 依據(jù) miRBase（http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/）數(shù)據(jù)庫中成熟的miRNA序列分別設(shè)計其莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物和特異性檢測引物見表1和表2。通用下游引物為:CTCAACTGGTGTCGTGGA。以U6基因作為內(nèi)參基因，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的U6序列（ID:26827）設(shè)計其特異性引物，上游引物為:CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物為:CGCTTCACGAATTTGCGT。所有引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 BCG的接種與培養(yǎng) 成功接種BCG于改良羅氏培養(yǎng)基中，37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)15～20天。利用含0.05%吐溫80的PBS洗滌BCG兩次，將BCG分散成單個菌，細胞計數(shù)后備用。

1.2.2 RAW264.7細胞培養(yǎng)與模型建立 將復(fù)蘇好的RAW264.7細胞調(diào)整密度為1×105個/ml，然后加入6孔板，每孔加2 ml含10%FBS的 RPMI 1640培養(yǎng)液，置37℃﹑5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時。換入新鮮培養(yǎng)液后，BCG與細胞按照10∶1比例加入，分別培養(yǎng)4、8、12、24小時收獲細胞，每組設(shè)三個重復(fù)。

1.2.3 small RNA的提取與cDNA的合成 首先向1×107m l－1的巨噬細胞中加入1 ml的 RNAiso for Small RNA，充分裂解細胞，室溫靜置5分鐘;然后加入200μl氯仿，蓋緊離心管蓋，用手劇烈振蕩，15秒;12 000 r/min 4℃離心15分鐘;吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中;向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，室溫靜置10分鐘;12 000 r/min 4℃離心10分鐘;小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75%（DEPC水配制）的乙醇1 m l，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12 000 r/min 4℃離心5分鐘后小心棄去乙醇;加入20μl的RNase-free水溶解沉淀。將提取的small RNA參照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進行cDNA合成，反轉(zhuǎn)錄條件為65℃ 10分鐘，25℃ 15分鐘 ，42℃60分鐘 ，85℃ 5分鐘。

表1 莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物Tab.1 Primers used for reverse transcription ofm iR-203，m iR-142-3p，m iR-21

表2 Real time PCR上游檢測引物Tab.2 Forward primers used for qRT-PCR

圖1 PCR結(jié)果圖Fig.1 The results of PCR

1.2.4 Real-time PCR 檢測 miR-203、miR-142-3p、miR-21的表達

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 （1）miR-203、miR-142-3p、miR-21基因的擴增與T載體構(gòu)建:以cDNA為模板，以通用下游引物，特異上游引物進行PCR，2.5%瓊脂糖電泳，將大小段正確的產(chǎn)物，參照Invitrogen T載體構(gòu)建說明書進行T載體構(gòu)建。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建:將T載體稀釋到1 ng/μl，按照10倍稀釋法，進行 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍比稀釋，各取2μl做模板，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2 miR-203、miR-142-3p、miR-21 的表達檢測應(yīng)用羅氏lightcycler實時定量PCR儀，反應(yīng)體系采用TaKaRa SYBR Green I試劑盒說明提供的反應(yīng)體系:SYBR Premix Ex.TaqTM（2 ×）10 μl，PCR 上下游引物（10 μmol/L）各 0.8 μl，模板 2 μl，ddH2O補充至20μl。反應(yīng)程序為:95℃ 30秒 1 cycle;95℃ 5秒，51℃ 20秒，72℃ 20秒，40 cycle;40℃ 20分鐘1 cycle;實驗設(shè)置3個平行復(fù)孔，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0醫(yī)學(xué)統(tǒng)計分析軟件進行分析，數(shù)據(jù)用x± s表示，P ＜0.05即為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 RAW264.7 巨噬細胞中 miR-203、miR-142-3p、miR-21的擴增 細胞中提取的small RNA經(jīng)RTPCR擴增，產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳，獲得大約60 bp（圖1）左右的目的條帶。測序結(jié)果表明，構(gòu)建的miR-203、miR-142-3p、miR-21 T載序列體完全正確。檢測結(jié)果表明，提取的所有樣品的Small RNA質(zhì)量較好，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA質(zhì)量較好，完全可以用于后續(xù)的Real-time PCR分析。

2.2 miRNA Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建與溶解曲線分析 對 miR-203、miR-142-3p、miR-21 T載體進行Real-time PCR擴增并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.99，顯示了良好的均一性，可用于定量檢測。同時進行融解曲線分析，均呈單一的峰值，擴增產(chǎn)物的退火溫度Tm值較均一（圖2），說明產(chǎn)物特異性良好，可用于后續(xù)檢測。

圖2 m iR-203、m iR-142-3p、m iR-21標(biāo)準(zhǔn)曲線及溶解曲線Fig.2 The standard curve and themelting curve ofm iR-203，m iR-142-3p，m iR-21

表3 m iR-203、m iR-142-3p、m iR-21熒光定量PCR結(jié)果Tab.3 m iR-203，m iR-142-3p，m iR-21 expression p rofile determ ined by RT-QPCR

2.3 miR-203、miR-142-3p、miR-21 熒光定量 PCR結(jié)果 BCG作用RAW 264.7巨噬細胞4、8、12小時后，miR-203、miR-142-3p顯著性低表達（表 3），24小時后miR-203表達量升高（表3）;而miR-21在4、8、12、24小時后表達都顯著性增加（表3）。

3 討論

miR-203是第一個被發(fā)現(xiàn)的皮膚特異性miRNA，在銀屑病皮損的角質(zhì)形成細胞中表達明顯升高。近期研究表明miR-203可以靶向抑制TLR4的表達，從而負(fù)向調(diào)節(jié)IL-6和TNF-α的產(chǎn)生。我的前期研究也證實miR-203也可以通過靶向作用Myd88負(fù)向調(diào)控TLRs信號通路的激活。另外，研究結(jié)果表明BCG刺激RAW264.7細胞8小時后，miR-203的表達下調(diào)20倍，而miR-203表達下調(diào)，可以導(dǎo)致TLR4與Myd88的表達升高，進而使得下游細胞因子IL-6和 TNF-α表達也相應(yīng)的升高，致使RAW264.7細胞發(fā)生炎性反應(yīng)。然而24小時后，miR-203表達卻升高了2倍，說明miR-203在巨噬細胞與結(jié)核分枝桿菌免疫應(yīng)答過程中的不同時間起著正向/負(fù)向的調(diào)控作用。在急性淋巴細胞白血病中研究發(fā)現(xiàn)miR-142-3p可以靶向作用mll-af4融合基因調(diào)控白血病的發(fā)生與發(fā)展［10］，另外在研究內(nèi)毒素誘導(dǎo)的DC細胞死亡中發(fā)現(xiàn)miR-142-3p可以靶向作用于IL-6負(fù)向調(diào)節(jié)DC細胞對內(nèi)毒素的免疫應(yīng)答反應(yīng)。我們的結(jié)果表明BCG作用巨噬細胞后miR-142-3p表達顯著性下調(diào)，我們推測miR-142-3p可能負(fù)向調(diào)節(jié)BCG與巨噬細胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)。此外，miR-21通過作用于PDCD4發(fā)揮對 TLR4通路的負(fù)向調(diào)控作用，從而負(fù)向調(diào)控固有免疫的強度。我們的研究還證實了miR-21對TLR4有直接的靶向的調(diào)控作用［11］。

我們建立BCG與小鼠RAW264.7巨噬細胞的相互作用的模型，定量檢測結(jié)果表明BCG感染巨噬細胞4、8、12、24 小時后 miR-203、miR-142-3p、miR-21表達量發(fā)生顯著性變化，說明這些miRNA在BCG誘導(dǎo)的巨噬細胞免疫應(yīng)答過程中有可能通過靶向作用相關(guān)免疫基因發(fā)揮免疫調(diào)控作用。通過miRanda、Targetscan、PicTar3個軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)這3個miRNA可以作用免疫信號通路中許多關(guān)鍵分子，如TIRAP、Socs3、Mapk1等。因此我們推測 miR-203、miR-142-3p、miR-21可能通過調(diào)控巨噬細胞免疫信號通路中關(guān)鍵分子，對其免疫應(yīng)答反應(yīng)進行調(diào)控。我們將在后續(xù)的研究中進行驗證，研究結(jié)果將為深入研究miRNA在機體免疫應(yīng)答中的調(diào)控作用提供依據(jù)。

1 Bartel D P.MicroRNAs:Genomics，biogenesis，mechanism，and function ［J］.Cell，2004;116（2）:281-297.

2 Brennecke J，Hipfner DR，Stark A etal.Bantam encodesa developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in drosophila ［J］.Cell，2003;113（4）:25-36.

3 Sun Y P，Varambally S，Cao Q et al.Targeting ofmicroRNA-142-3p in dendritic cells regulates endotoxin-induced mortality［J］.Blood，2011;117（23）:6172-6183.

4 Sheedy F J，Palsson-McDermott E，Hennessy E J et al.Negative regulation of TLR4 via targeting of the proinflammatory tumor suppressor PDCD4 by the microRNA miR-21［J］.Nature Immunology，2010;11:141-147.

5 Johnnidis JB，HarrisM H，Wheeler R T et al.Regulation of progenitor cell proliferation and granulocyte function bymicroRNA-223［J］.Nature，2008;451:1125-1129.

6 Benakanakere M R，Li Q Y，Eskan M A et al.Modulation of TLR2 protein expression bymiR-105 in human oral keratinocytes［J］.Biol Chem，2009;284（34）:23107-23115.

7 Chen X M，Splinter P L，O'Hara SP et al.A cellularmicro-RNA，let-7i，regulates Toll-like receptor 4 expression and contributes to cholangiocyte immune responses against cryptosporidium parvum infection［J］Biol Chem，2007;282（39）:28929-28938.

8 Taganov K D，Boldin M P，Chang K J et al.NF-kappaB-dependent induction of microRNA miR-146，an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune Responses［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006;103（33）:12481-12486.

9 Hou J，Wang P，Lin L etal.MicroRNA-146a feedback inhibits RIGI-dependent Type I IFN production in macrophages by targeting TRAF6，IRAK1，and IRAK2［J］. Immunol，2009;183（3）:2150-2158.

10 竇立萍，李永輝，徐誠望etal.miR-142-3p靶向調(diào)控mll-af4融合基因的實驗研究［J］.中國實驗血液學(xué)雜志，2010;18（6）:1595-1599.

11 趙 婧，徐廣賢，魏 軍 et al.pri-miR-21重組腺病毒載體構(gòu)建及其對TLR4基因調(diào)控的研究［J］.細胞與分子免疫學(xué)雜志，2012;28（2）:153-156.

［收稿2012-09-04 二次修回2012-11-12］

（編輯 倪 鵬）

Effect of BCG on expression of m iR-203，m iR-142-3p and m iR-21 in mouse RAW 264.7 macrophages

ZHANGZhao-Bo，WEIJun，TANGJian-Zhong，ZHAOZhi-Jun，ZHANGYi-Lin，ZHANGRui-Qin，XUGuang-Xian.InstituteofLaboratoryMedicine，NingxiaMedicalUniversity，Yinchuan750004，China

Objective:To detect the influence of Bacillus Calmette-Guerin（BCG）on the expression ofmiR-203，miR-142-3p and miR-21 in themacrophages and provide the basis to study the regulation ofmiRNA in the immune response ofmacrophages to Mycobacterium tuberculosis.Methods:Small RNA was extracted at different times after stimulated with a concentration of1.0 ×107ml－1of BCG in cultured mouse RAW264.7 cells.After using stem-loop reverse transcription primers to reverse transcribed into cDNA，the expression ofmiR-203，miR-142-3p and miR-21 was detected by Real-time PCR.At the same time，building the T vector ofmature miR-203，miR-142-3p and miR-21 tomake the standard curve.Results:After RAW264.7 cellswas treated by BCG for4，8，12 and 24 h，miR-21 expression was up-regulated significantly（More than 10 times，P ＜ 0.05）.However，miR-142-3p was significantly down-regulated at the same time（More than 20 times，P ＜0.05）.miR-203 expression was down-regulated after treated for4，8 and 12 h（More than 3 times，P ＜0.05），butwas up-regulated at24h（More than 2 times，P ＜0.05）.Conclusion:The expression ofmiR-203，miR-142-3p andmiR-21 was significantly changed after BCG stimulated RAW264.7 macrophages，indicated that themiRNAmay play an important role in themacrophages antimycobacterium tuberculosis immune responses through the regulation of immune-related genes.

miRNA;BCG;real-time PCR

R392.1

A

1000-484X（2013）02-0125-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2013.02.003

①本文為國家自然科學(xué)基金資助項目（No.31160494，30960275）、教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃”項目（No.NCET 11-11023）、中國博士后基金項目（No.20110491554）、寧夏醫(yī)科大學(xué)“博士學(xué)位建設(shè)學(xué)科”開放課題（No.KF2010-41）

②寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗中心，銀川750004

張兆波（1986年－）男，在讀碩士，臨床檢驗診斷學(xué)專業(yè);

及指導(dǎo)教師:徐廣賢（1973年－），男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事臨床病原微生物與免疫學(xué)檢驗方面的研究，E-mail:xgx205079@sina.com.cn;guangxianxu2004@yahoo.com.cn。