蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在骨關(guān)節(jié)炎研究中的應(yīng)用探討

葛曙光

山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030000

隨著科技的發(fā)展以及人類(lèi)對(duì)于基因的研究深入，生命科學(xué)已經(jīng)進(jìn)入一個(gè)后基因組學(xué)的時(shí)代。其中蛋白質(zhì)組學(xué)是其中一個(gè)后基因組學(xué)時(shí)代的一個(gè)研究熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)組學(xué)是指研究生物體或者細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)組成以及其相應(yīng)規(guī)律的科學(xué)。主要是通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行前處理后，對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)以及多胎碎片進(jìn)行分離以及鑒定，同時(shí)對(duì)比數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)從而得到相應(yīng)的生物信息。這對(duì)于病因不明確的疾病，了解其致病發(fā)病的機(jī)理以及治療途徑等均有著顯著的積極影響。骨關(guān)節(jié)炎癥是一種慢性疾病，對(duì)于患者的日常生活質(zhì)量影響較大。目前臨床上對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎的治療仍未有治療效果較為滿(mǎn)意的手段。通過(guò)了解骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)理，針對(duì)性提出相應(yīng)的治療方案，使得骨關(guān)節(jié)炎能夠得到更好的治療，取得滿(mǎn)意的臨床效果[1]。該文主要是對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用在骨關(guān)節(jié)炎中進(jìn)行研究討論。

1 蛋白組學(xué)技術(shù)

蛋白組學(xué)技術(shù)研究主要是圍繞兩種蛋白組學(xué)進(jìn)行研究探討。一種是表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)，這主要是應(yīng)用在生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究；另一種是功能蛋白質(zhì)組學(xué)，主要是研究與疾病有關(guān)的患者出現(xiàn)個(gè)體差異的表達(dá)蛋白質(zhì)。對(duì)于臨床上研究，主要針對(duì)功能蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行一系列相關(guān)的研究。臨床蛋白質(zhì)組學(xué)主要是針對(duì)以下幾個(gè)方法進(jìn)行探討，其中包括疾病模型蛋白質(zhì)組學(xué)研究、疾病生物標(biāo)記物的研究、藥物蛋白質(zhì)靶向藥物的研究。低豐度蛋白質(zhì)在人體生命活動(dòng)調(diào)節(jié)中起著重要的作用，因此蛋白質(zhì)組學(xué)的研究熱點(diǎn)以及研究的難點(diǎn)主要是對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的分離以及鑒別。目前對(duì)于低豐度蛋白質(zhì)的研究測(cè)定主要是通過(guò)兩種分析技術(shù)進(jìn)行分析研究，最常用的是雙電泳技術(shù)以及質(zhì)譜分析技術(shù)。這兩種技術(shù)共同特點(diǎn)是能夠分離樣品中的雜質(zhì)同時(shí)能夠定量測(cè)定樣品中目標(biāo)物質(zhì)的含量。由于蛋白質(zhì)的分子相對(duì)較大，而且較容易變形，因此對(duì)于蛋白質(zhì)的研究，樣品的前處理是相對(duì)較為關(guān)鍵的步驟[2]。雙電泳技術(shù)主要是通過(guò)凝膠電泳將蛋白質(zhì)進(jìn)行高效的分離后，得到轉(zhuǎn)錄后的蛋白質(zhì)異構(gòu)體，然后通過(guò)數(shù)據(jù)的查詢(xún)對(duì)比，以及根據(jù)測(cè)定樣品的等電位點(diǎn)以及分子量等信息，分析樣品的生物活性以及根據(jù)斑塊的大小等進(jìn)行定量分析。而質(zhì)譜技術(shù)主要是對(duì)樣品進(jìn)行離子化，對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)的分子量以及氨基酸序列的分析。質(zhì)譜技術(shù)屬于半定量的分析方法，可以串聯(lián)其他技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)一起進(jìn)行分析定量鑒別使用。

2 骨關(guān)節(jié)蛋白組學(xué)研究

人體關(guān)節(jié)中一般包括有三大標(biāo)本部分，分別是軟骨標(biāo)本、關(guān)節(jié)液標(biāo)本以及滑膜標(biāo)本。不同的標(biāo)本類(lèi)型有著不同的處理方法。在蛋白組學(xué)中樣品的前處理是整個(gè)研究過(guò)程中較為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。以下將對(duì)各種不同關(guān)節(jié)類(lèi)型的樣品的前處理進(jìn)行分析討論。

2.1 軟骨關(guān)節(jié)前處理

其中軟骨標(biāo)本包括軟骨細(xì)胞以及軟骨蛋白組學(xué)的研究。其中軟骨細(xì)胞分離主要是在胰蛋白酶或者膠原酶在接近人體體溫37℃進(jìn)行軟骨細(xì)胞的分離，然后在DMEM以及10%的FCS的條件下進(jìn)行軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)。培養(yǎng)后需要手機(jī)軟骨細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，主要是利于胰蛋白酶的消化作用進(jìn)行收集以及培養(yǎng)。然后在采用尿酸溶解緩沖液提取蛋白質(zhì)，即可完成前處理。而軟骨蛋白質(zhì)組學(xué)的研究則主要是在-80℃的條件下進(jìn)行粉碎，然后在NaCL以及HEPES的緩沖液中進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取，采用CPC沉淀的方法將聚集蛋白聚糖去除，然后進(jìn)行蛋白質(zhì)的沉淀，經(jīng)過(guò)DOC以及TCA的樣本洗滌后，在尿酸溶解緩沖液中溶解，然后進(jìn)行軟骨的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[3]。

一般對(duì)于關(guān)節(jié)炎病理的研究主要是采用動(dòng)物模型。一般采用小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，這是由于小鼠的個(gè)體差異較少，并且其對(duì)照較好，因此主要應(yīng)用在骨關(guān)節(jié)炎的研究中。目前一些研究已經(jīng)在病理狀態(tài)下以及正常狀態(tài)下找到兩者蛋白質(zhì)的差異，對(duì)于發(fā)病機(jī)制等仍需要進(jìn)一步研究探索。

2.2 關(guān)節(jié)液的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

對(duì)于關(guān)節(jié)液的前處理，主要有以下幾步。采集關(guān)節(jié)液的標(biāo)本后，需要采用親和力較強(qiáng)的色譜進(jìn)行白蛋白以及IgG的去除。然后采用DOC/TCA對(duì)樣本進(jìn)行洗滌沉淀蛋白后將樣品溶解在尿素溶解緩沖液中，將蛋白質(zhì)溶解，即可進(jìn)行關(guān)節(jié)液的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

關(guān)節(jié)液主要是在骨關(guān)節(jié)中起到潤(rùn)滑的作用，關(guān)節(jié)液中含有部分從軟骨關(guān)節(jié)中釋放的蛋白質(zhì)。這部分蛋白質(zhì)會(huì)隨著關(guān)節(jié)液和血液之間的交換將部分的軟骨細(xì)胞以及基質(zhì)帶到血液中。因此對(duì)于關(guān)節(jié)液的研究，還可以從血漿中進(jìn)行。目前已經(jīng)有研究證實(shí)[9]在關(guān)節(jié)液以及血液中能夠發(fā)現(xiàn)部分的關(guān)節(jié)炎癥的標(biāo)記物。這對(duì)于靶向藥物的開(kāi)發(fā)等有著重要的提示意義。一旦骨關(guān)節(jié)炎標(biāo)記物能在血液中被鑒定，能提高骨關(guān)節(jié)炎的診斷的速度以及準(zhǔn)確率。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎癥的診斷也有一定的積極意義。

2.3 滑膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究

滑膜同樣也分為滑膜細(xì)胞以及滑膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究。其中滑膜細(xì)胞的研究需要在胰蛋白酶的作用下，在37℃的反應(yīng)條件下進(jìn)行滑膜細(xì)胞的分離，然后在RPMI以及10%的FCS的條件下進(jìn)行軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)，然后在胰蛋白酶的消化下進(jìn)行軟骨細(xì)胞的收集以及原代培養(yǎng)，然后在尿素溶解緩沖溶液中進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取，即可進(jìn)行滑膜細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究[5]。而對(duì)于滑膜蛋白質(zhì)組學(xué)的研究則主要是在-80℃的條件下進(jìn)行粉碎，然后在飛例子裂解緩沖液中進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取，然后采用DOC/TCA對(duì)樣本進(jìn)行洗滌將蛋白質(zhì)進(jìn)行沉淀，然后在尿素溶解緩沖液中將蛋白質(zhì)進(jìn)行溶解，隨即可開(kāi)始滑膜蛋白質(zhì)組學(xué)的研究[6]。

3 骨關(guān)節(jié)炎炎癥細(xì)胞的研究

臨床上已經(jīng)證實(shí)，前炎性細(xì)胞因子，腫瘤壞死因子是導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的主要的炎癥致病因子。蛋白組組學(xué)的其中一種技術(shù)是將這些導(dǎo)致發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎的因子對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行刺激以及移植，觀(guān)察軟骨發(fā)病以及退變的過(guò)程，這對(duì)于研究軟骨發(fā)病以及退變的機(jī)制研究有著重要的意義。同時(shí)在小鼠的軟骨移植物種出現(xiàn)有類(lèi)似的組織生長(zhǎng)因子碎片。在動(dòng)物骨關(guān)節(jié)炎模型中，可以觀(guān)察到組織生產(chǎn)因子在骨關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)炎軟骨以及關(guān)節(jié)液的表達(dá)中會(huì)受到一定的反饋性調(diào)劑。

4 討論

由于人體組成含有大量的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，并且在骨關(guān)節(jié)炎的研究中取得相應(yīng)的成效，對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制以及相應(yīng)的治療手段仍處于初步的研究開(kāi)發(fā)階段。目前主要是以發(fā)現(xiàn)差異蛋白為主。另外對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)在骨關(guān)節(jié)炎的研究分析手段、研究方法以及數(shù)據(jù)處理等方面仍需要進(jìn)一步的發(fā)展。蛋白質(zhì)組學(xué)為日后骨關(guān)節(jié)炎研究、骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制以及值得相應(yīng)的藥物和治療方案中均具有積極重大的意義。

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[2]黃玉佳.類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)組學(xué)分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2011(21)：135-136.

[3]梁清華，蔣勇前，熊新貴，等.痹腫消湯干預(yù)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010（11）：1160-1164.

[4]萬(wàn)春友，馮強(qiáng)，張福江，等.類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)組學(xué)分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2011（3）：185-189.

[5]王建光.類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D].上海：第二軍醫(yī)大學(xué),2011.

[6]謝秀麗，劉健，萬(wàn)磊，等.活動(dòng)期類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎蛋白質(zhì)代謝變化及相關(guān)性分析[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2010(5)：982-985.