幾種植物精油對冬棗病原菌的抑菌試驗

宋姝婧，許牡丹，王曉拓，王志東

（1.陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西 西安 710000；2.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100000）

果蔬產(chǎn)品在采后會發(fā)生一系列生理病理的變化，冬棗在貯藏后期隨著果實的成熟衰老，其抗病性也逐漸降低，腐爛率也大大增加。傳統(tǒng)的冬棗保鮮所采用的都是成本低廉、使用方便、效果顯著的化學殺菌劑，但是大規(guī)模地使用化學殺菌劑不僅會導致病原菌產(chǎn)生抗藥性，還會造成果蔬的農(nóng)藥殘留和污染環(huán)境［1］，這與現(xiàn)如今人們所追求的綠色、環(huán)保以及吃健康食品的觀念背道而馳。因此研究開發(fā)無毒、高效的天然防腐保鮮劑已成為一項極為迫切的任務。

近年來，植物精油以其顯著的抑菌活性和廣泛的抗菌譜范圍，以及與化學抑菌劑相比副作用和殘留毒性小的獨特優(yōu)勢，在抑菌研究方面得到了廣泛的關(guān)注，被認為是開發(fā)天然防腐保鮮劑的重要原料［2，3］。目前植物精油對冬棗主要采后致病菌的抑制效果研究較少，冬棗精油天然防腐保鮮劑的開發(fā)也鮮見報道。本實驗以陜西地區(qū)冬棗采后貯藏中分離鑒定的病原菌作為供試菌種，對5 種天然植物精油（羅勒精油、薰衣草精油、紅百里香精油、松紅梅精油、迷迭香精油）進行抑菌試驗，篩選可有效抑制病原菌的植物精油，為冬棗采后病害的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

冬棗為陜西渭南市售的在半紅期采摘的果實，挑選無病蟲害和機械傷的鮮果用流動水沖洗，表面自然瀝干，置于室溫進行貯藏，讓其在貯藏的過程中病變。

植物精油羅勒精油、薰衣草精油、紅百里香精油、松紅梅精油和迷迭香精油均購自上海雅琪實業(yè)有限公司，試驗前置于低溫（4 ℃）避光環(huán)境下保存。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與純化 采用常規(guī)方法，在PDA 培養(yǎng)基中分離病原菌，待產(chǎn)孢后對病原菌孢子進行濃度梯度稀釋，涂于平皿，并在28 ℃培養(yǎng)2d后于倒置顯微鏡下挑取單孢子，移入另一裝有PDA 的平皿，28 ℃培養(yǎng)，待菌絲長出后，即得純化菌株。

1.2.2 標準菌懸液的制備 挑取各菌落接種到平皿上，進行培養(yǎng)，然后用無菌生理鹽水洗脫，分別制成含菌約為1 mL 106 個菌的菌懸液，備用。霉菌、酵母菌使用顯微鏡直接計數(shù)法測菌體個數(shù)［4，5］。

1.2.3 濾紙片法測定抑菌圈 選擇吸水性強的定性濾紙，用打孔器打成若干直徑為6 mm的圓形濾紙片，放入電熱干燥箱中經(jīng)160 ℃干熱滅菌2h后，把滅好菌的濾紙片放入植物精油中浸漬4h，取出濾紙片放在無菌的條件下瀝干備用。將活化并調(diào)整好菌液濃度的酵母菌菌懸液0.1 mL 加入已經(jīng)倒好的YPD 培養(yǎng)基平皿中，根霉菌倒入察氏培養(yǎng)基平皿上，并涂布均勻。取浸泡過精油的濾紙片貼在含菌平皿上，每皿平行做3片，每種菌平行做3個皿。然后用相應的提取溶劑作陰性對照，用青霉素G作陽性對照。酵母菌、根霉菌置培養(yǎng)箱中28℃恒溫培養(yǎng)48h。選取抑菌圈比較明顯的平板，用十字交叉法測量菌落生長的直徑，結(jié)果取3次重復試驗的平均值［6-8］。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）的測定 在無菌條件下，將植物精油稀釋成下列不同濃度梯度：200、100、50、25、12.5、6.25μL／mL。吸取各濃度稀釋液1mL，分別加到已滅菌的9mL PDA培養(yǎng)基中制成帶藥的平皿，編號后吸取待測菌種的懸浮液100μL 于平皿表面，涂布均勻，酵母菌、根霉菌置于恒溫箱28 ℃下培養(yǎng)48h，以完全沒有菌生長的最低濃度作為該精油的最低抑菌濃度（MIC）［9，10］。

1.2.5 最低殺菌濃度（MBC）的測定 將在測定最低抑菌濃度（MIC）試驗中沒有長菌的平皿繼續(xù)培養(yǎng)48h后取出觀察，以完全無菌生長的為最低殺菌濃度（MBC）［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬棗病原菌鑒定

從貯藏的冬棗果實上分離出兩種病原菌，挑取各菌落少許到載玻片上，用顯微鏡觀察、測量，根據(jù)各病原菌的形態(tài)特征對其進行鑒定。經(jīng)過鑒定冬棗上分離出的兩種病原菌是酵母菌和根霉菌。

酵母菌菌落呈現(xiàn)乳白色，少數(shù)為紅色，表面光滑濕潤，質(zhì)地柔軟不透明，菌落直徑為1～2mm。孢子為圓形，單生或成串。

根霉菌菌落呈圓形，初形成時為灰白色和黃白色，成熟后變?yōu)楹谏?，匍匐菌絲弧形，無色，向四周蔓延。孢子囊剛出現(xiàn)時為黃白色，成熟后變?yōu)楹谏?/p>

2.2 5種植物精油對冬棗病原菌抑制效果

2.2.1 抑菌圈的大小 5種植物精油、無菌生理鹽水和青霉素G 對冬棗病原菌的抑菌作用如表1。參照李春美等［12］抑菌實驗判定標準（抑菌圈直徑大于15 mm 為最敏感，10～15mm時為中度敏感，7～9 mm 為低度敏感，無抑菌圈者不敏感），認為5種植物精油中紅百里香精油對兩種病原菌表現(xiàn)出了最強的抑菌活性，抑菌圈直徑均大于20mm，屬最敏感；羅勒精油對根霉菌的抑制作用僅次于紅百里香精油，也屬最敏感，而對酵母菌屬于中度敏感；薰衣草精油、松紅梅精油對酵母菌的抑菌圈直徑介于7～9 mm，屬低度敏感，而這兩種精油對根霉菌屬中度敏感；迷迭香精油對酵母菌屬低度敏感，而對根霉菌屬中度敏感。綜合比較來看，5種精油對根霉菌的抑制作用要強于對酵母菌的抑制作用。

表1 植物精油對冬棗病原菌的抑菌圈直徑 ／mm

2.2.2 5種植物精油MIC 的測定 表2列出了供試菌種在不同精油濃度下生長狀況和MIC值，精油的MIC 值越小，說明精油抑制作用越強。從表3中可以看出，酵母菌和根霉菌在不同濃度的精油作用下，生長狀況差異明顯，試驗所得到的MIC值與濾紙片法所得到的結(jié)果是基本一致的。紅百里香精油對酵母菌和根霉菌都表現(xiàn)出了強烈的抑制作用，最低抑菌濃度均為0.625μL／mL；而羅勒精油對根霉菌表現(xiàn)出的抑制作用遠遠大于對酵母菌所表現(xiàn)的抑制作用，對酵母菌的MIC是10μL／mL，對根霉菌的MIC是1.25μL／mL；松紅梅精油和迷迭香精油對根霉菌抑菌作用較弱，而對于酵母菌的抑制作用極小，超出了實驗所設的濃度梯次范圍；迷迭香精油對根霉菌的 MIC 為20μL／mL；薰衣草精油對酵母菌和根霉菌也都表現(xiàn)出了一定的抑制作用，對酵母菌的MIC 為20μL／mL，對根霉菌的MIC為10μL／mL。

表2 植物精油對供試菌種的抑菌濃度 ／（μL／mL）

2.2.3 5種植物精油MBC的測定 表3列出了供試菌種在不同精油濃度下生長狀況和MBC值。從表3中可以看出，紅百里香精油對酵母菌和根霉菌都表現(xiàn)出了強烈的殺菌能力，紅百里香精油對酵母菌和根霉菌的MBC 值分別是1.25μL／mL 和2.5μL／mL，為5種植物精油中最低的殺菌濃度；相對酵母菌，羅勒精油對根霉菌表現(xiàn)出了更強的殺菌能力，MBC 值分別為20μL／mL 和5μL／mL；其余幾種精油對供試菌的殺菌能力都比較弱。

表3 植物精油對供試菌種的殺菌濃度 ／（μL／mL）

3 結(jié)論

對貯藏的病變冬棗上的病原菌進行分離、提純、鑒定，結(jié)果表明導致冬棗病變的主要病原菌為酵母菌和根霉菌。5種植物精油均對酵母菌、根霉菌有一定的抑制能力，其中紅百里香精油對酵母菌和根霉菌有著最強的抑制作用，抑菌圈直徑分別為（22.43±0.06）mm、（23.48±0.06）mm。紅百里香精油對酵母菌的MIC 值是0.625μL／mL，MBC 值是1.25μL／mL，對根霉菌的MIC 是0.625μL／mL，MBC 值是2.5μL／mL。另外，5 種植物精油均表現(xiàn)出對根霉菌的抑制效果強于酵母菌的特點，其作用機理尚需進一步研究。綜上，紅百里香精油對冬棗采后病原菌有很強的抑制能力，可作為開發(fā)冬棗天然防腐保鮮劑的重要原料，關(guān)于其對冬棗的保鮮防腐效果尚需具體研究，使其更具實際應用性。

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