基于PCR技術(shù)的現(xiàn)代分子生物學(xué)操作在中藥鑒定中的應(yīng)用

詹立平 趙 鑫 劉志梅

1.遼寧衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，遼寧沈陽 110101；2.遼寧林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院高職教育研究所，遼寧沈陽 110101

我國勞動人民幾千年來在與疾病作斗爭的過程中，通過實(shí)踐，逐漸積累了豐富的醫(yī)藥知識。千百年來，中藥在維系國人的身體健康方面發(fā)揮了不可替代的作用。中藥包括植物藥、動物藥和礦物藥，品種繁多，加之各地的用藥品種和用藥習(xí)慣不盡相同，同名異物和同物異名現(xiàn)象屢見不鮮。為規(guī)范藥材市場、鑒定中藥真?zhèn)蝺?yōu)劣，確保中藥的質(zhì)量與療效，建立一套準(zhǔn)確、簡捷、迅速的鑒定方法迫在眉睫。

近年來分子生物學(xué)的發(fā)展突飛猛進(jìn)，特別是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)的問世，推動分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域向縱深發(fā)展[1]?；赑CR技術(shù)的現(xiàn)代分子生物學(xué)操作在中藥鑒定中得到應(yīng)用，以其獨(dú)具的準(zhǔn)確性和可靠性，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)中藥鑒定中的許多不足，展現(xiàn)出其他方法難以比擬的優(yōu)勢。

本文以PCR技術(shù)為切入點(diǎn)，著重介紹目前在中藥鑒定中運(yùn)用較多的幾種分子生物學(xué)操作技術(shù)，希望能夠拋磚引玉，合眾人之力增加中藥鑒定中的現(xiàn)代元素，推動中藥鑒定方法的改進(jìn)與革新。

1 PCR技術(shù)概述

PCR技術(shù)由美國Karray等學(xué)者于1985年首創(chuàng)， 并由美國Cetus公司開發(fā)研制。PCR技術(shù)原理是根據(jù)已知DNA片段序列，人工合成與該DNA 兩條鏈末端互補(bǔ)的寡核苷酸引物，在酶促作用下將待檢DNA 序列進(jìn)行體外擴(kuò)增。

PCR 反應(yīng)體系基本成分包括模板DNA（待擴(kuò)增DNA）、引物、4 種脫氧核苷酸（dNTPs）、DNA 聚合酶和適宜的緩沖液。類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制過程，PCR 反應(yīng)的特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。

PCR 由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①變性：模板DNA 經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，雙鏈DNA解離為單鏈；②退火：模板DNA 經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA 單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③延伸：DNA 模板與引物的結(jié)合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP 為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對原則，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)上述反應(yīng)步驟，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。如此循環(huán)往復(fù)，在短短的幾個(gè)小時(shí)的時(shí)間里，模版DNA 鏈便可被擴(kuò)增幾百萬倍。

PCR技術(shù)使人們能夠在體外進(jìn)行DNA的復(fù)制，它的意義在于DNA是遺傳密碼的載體，具有相對的遺傳穩(wěn)定性，每種生物都有其固定的遺傳密碼。只要得到某種物質(zhì)的微量細(xì)胞并將其細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)提取出來，再通過PCR技術(shù)將其擴(kuò)增，就會準(zhǔn)確無誤地判斷該物質(zhì)，進(jìn)而判斷該物種。PCR技術(shù)以其獨(dú)具的可靠性和準(zhǔn)確性，在中藥材基原鑒定和真?zhèn)舞b別方面擁有廣闊的應(yīng)用空間。

2 基于PCR技術(shù)的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)

PCR技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)的基石，該項(xiàng)技術(shù)的問世具有劃時(shí)代的意義。以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，分子生物學(xué)領(lǐng)域衍生出多種新的實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)，在生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域均得到廣泛的應(yīng)用。本文僅對應(yīng)用于中藥鑒定過程的幾種操作技術(shù)進(jìn)行介紹。

2.1 RAPD 技術(shù)

RAPD 即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA，該技術(shù)建立在PCR技術(shù)基礎(chǔ)之上，可對整個(gè)未知序列的基因進(jìn)行多態(tài)性分析操作。RAPD 技術(shù)以基因組DNA 為模板，以單個(gè)人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列為引物，在熱穩(wěn)定的DNA 聚合酶（Taq 酶）作用下，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳、染色后，在紫外透視儀上檢測多態(tài)性。擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性反映了基因組的多態(tài)性。

目前，RAPD 技術(shù)已應(yīng)用于中藥材的種質(zhì)鑒定及偽品鑒別等方面。徐鵬等[2]運(yùn)用RAPD 技術(shù)對廣西鉤藤屬藥用植物進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，獲得多態(tài)性條帶231 條，多態(tài)率達(dá)到88.9%。結(jié)果表明，3 種廣西鉤藤屬藥用植物的聚類結(jié)果與其地理分布一致，所得RAPD 標(biāo)記可用于鉤藤屬藥用植物的多態(tài)性研究；李雄英等[3]運(yùn)用RAPD 技術(shù)對絞股藍(lán)及其偽品進(jìn)行DNA 指紋圖譜的鑒別研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該技術(shù)可有效地鑒別絞股藍(lán)及其偽品烏蘞莓。

2.2 ISSR-PCR技術(shù)

簡單序列重復(fù)區(qū)間（inter-simple sequence repeats，ISSR）是近年來發(fā)展起來的一類新型的分子標(biāo)記技術(shù)，具有多態(tài)性高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于藥用植物的鑒定和遺傳多樣性研究[4]。柴素芬等[5]以象頭山蕓香科植物為研究對象，從DNA 提取、退火溫度、循環(huán)次數(shù)、引物篩選等方面研究ISSR 反應(yīng)及優(yōu)化條件，建立和優(yōu)化蕓香科藥用植物的ISSR 反應(yīng)體系。結(jié)果表明，ISSR 技術(shù)適合于蕓香科藥用植物的品種鑒定，同時(shí)可為蕓香科藥用植物的資源評價(jià)提供依據(jù)。

2.3 PCR 擴(kuò)增的特定片段的限制性位點(diǎn)分析

限制性片段長度多態(tài)性 （restriction fragment length polymorphism，RFLP）利用放射性標(biāo)記的探針，通過雜交顯示特定的基因組DNA 酶切片段，從而構(gòu)建多態(tài)性的DNA圖譜。它代表的是基因組DNA 在限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生的片段在長度上的差異。

PCR-RFLP 技術(shù)綜合RFLP 技術(shù)與PCR技術(shù)二者的優(yōu)勢，用特異性的引物先對模板DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，獲得特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，之后利用多種不同的限制性內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶解，構(gòu)建物理圖譜，分析限制性位點(diǎn)在分類群中的差異。該方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，在中藥鑒定研究中有一定的應(yīng)用報(bào)道。吳平等[6]從5 種海馬干標(biāo)本中提取DNA，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增12SrRNA 和細(xì)胞色素b 基因片段，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行RFLP分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，采用PCR-RFLP技術(shù)可鑒別出其中的兩種海馬。

2.4 mRNA 差異顯示技術(shù)

mRNA 差異顯示技術(shù)通過將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，由此分離出不同分子大小的DNA，選擇有差異表達(dá)的基因進(jìn)行序列分析。該技術(shù)具有快速、多功能、所需RNA 量少和重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于分離克隆真核生物差異表達(dá)的基因[7]。目前，該技術(shù)在藥學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用僅處于起步狀態(tài)，借助該技術(shù)可以將栽培品種與野生種、道地藥材與普通藥材之間的差異鑒別出來。因此，mRNA 差異顯示技術(shù)在中藥材的質(zhì)量鑒定方面將擁有廣闊的應(yīng)用空間。

2.5 基因測序

基因測序是對藥材特定的基因片段進(jìn)行精確的DNA序列分析，并加以比較，從而達(dá)到鑒別藥材的目的。常用的基因片段包括線粒體細(xì)胞色素基因和rRNA 基因等。用于基因測序的基因在種內(nèi)高度保守，而在種間序列的差異較大，適用于中藥材種間的鑒定。

徐麗等[8]從冬蟲夏草與其他品系蟲草及其混淆品蟲草中提取DNA，對核糖體基因（rDNA）進(jìn)行測序，設(shè)計(jì)18S 基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，直接測序。結(jié)果表明，冬蟲夏草與西藏白草、西藏黑草、無頭草、默勒草的18 S 序列相似度為100%；與亞香棒、北蟲草的18S 序列相似度分別為91.37%和91.74%。由此可見，18S 序列可有效地鑒別冬蟲夏草及其混淆品北蟲草和亞香棒蟲草。此外，基因測序技術(shù)也被報(bào)道應(yīng)用于三七[9]及其偽品的遺傳背景差異分析、巴戟天[10]道地性研究及半夏[11]的基原鑒別。

2.6 基因芯片

基因芯片又稱DNA 芯片，是專門用于核酸檢測的生物芯片?；蛐酒闹饕夹g(shù)流程為：芯片的制備→樣品的制備→雜交反應(yīng)→芯片信號的檢測與分析→芯片數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析和生物學(xué)分析。即在固相載體上按照特定的排列方式固定大量序列已知的DNA 片段，將樣品基因組DNA 或RNA 經(jīng)過PCR 或RT-PCR 擴(kuò)增等技術(shù)摻入標(biāo)記分子后，與已知序列雜交，通過熒光檢測系統(tǒng)對芯片進(jìn)行掃描，檢測雜交信號強(qiáng)度，利用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析后，即可獲得樣品中大量的基因序列特征或基因表達(dá)特征信息?；蛐酒夹g(shù)可為植物種屬的驗(yàn)證與質(zhì)量控制提供一種快速、高質(zhì)量的檢測工具。楊忠等[12]利用基因芯片技術(shù)對多種貝母根莖的基因組DNA 進(jìn)行操作，結(jié)果顯示不同貝母種屬可在芯片不同位置檢測到熒光信號，從而提供了一種快速高效的集基因分型與中藥鑒別于一體的方法。

3 展望

與傳統(tǒng)的中藥鑒別方法相比，基于PCR技術(shù)的分子生物學(xué)鑒定技術(shù)具有準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定、可靠的優(yōu)點(diǎn)。利用現(xiàn)代化分析技術(shù)可準(zhǔn)確鑒別中藥的真?zhèn)?，從而完善中藥質(zhì)量評價(jià)體系，保證中藥安全、有效、可控。目前，最重要的是要充分了解各項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)勢，以便取長補(bǔ)短、綜合利用，滿足市場對藥材準(zhǔn)確鑒定的需求。

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