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    混合樹脂吸附兩性霉素B雜質(zhì)比例研究

    2013-01-31 06:18:38付蘊(yùn)敏
    機(jī)電信息 2013年8期
    關(guān)鍵詞:兩性霉素大孔容量瓶

    付蘊(yùn)敏

    (上海新亞藥業(yè)有限公司新先鋒制藥廠,上海201203)

    0 引言

    兩性霉素B為多烯類抗真菌抗生素,臨床上用于治療深部真菌引起的內(nèi)臟或全身感染,該藥物已有50余年的歷史。近年來,隨著廣譜抗菌素和皮質(zhì)激素的廣泛應(yīng)用,腫瘤和化療病人的增多,介入治療和深靜脈置管技術(shù)的開展,真菌深部感染的發(fā)生率大幅度上升。兩性霉素B因其抗菌譜廣、療效確切,在臨床上有不可替代的價(jià)值。

    大孔吸附樹脂是一類不含交換基團(tuán),且具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子吸附樹脂,具有物理化學(xué)穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、再生處理方便等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于藥物成分的提取、分離、純化工作中。傳統(tǒng)的兩性霉素B原料藥純化工藝要經(jīng)過多次重復(fù)結(jié)晶才能達(dá)到質(zhì)量要求,收率低、周期長、成本高。本方法是將此大孔樹脂吸附技術(shù)運(yùn)用于兩性霉素B純化過程,將2種不同的樹脂按最佳比例混合起來,有選擇性地吸附兩性霉素B溶解液中的雜質(zhì)來純化兩性霉素B,提高兩性霉素B原料的質(zhì)量。

    1 材料與儀器設(shè)備

    上海華震科技有限公司大孔樹脂型號(hào):D832和D816;兩性霉素B,上海新亞藥業(yè)有限公司;600mm×50mm層析柱,國藥試劑儀器有限公司;高效液相色譜儀,Agilent1100;YZ156恒流泵,保定蘭格恒流泵有限公司;磁力攪拌器,國藥試劑儀器有限公司;恒溫水浴鍋,國藥試劑儀器有限公司;DMF、乙醇、甲醇、丙酮等試劑均為工業(yè)級(jí)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 分析方法(HPLC法兩性霉素B含量測(cè)定)

    儀器:高效液相色譜儀,Agilent1100。

    流動(dòng)相A:乙腈—甲醇—含0.073%乙二胺四乙酸的0.05 mol/L醋酸銨溶液(用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.0)(260:450:320);流動(dòng)相B:乙腈—甲醇(260:450);檢測(cè)波長:405 nm;流速:1.0m L/m in;進(jìn)樣量:20μL。

    取供試品溶液10m L,加0.01mol/L鹽酸溶液100μL,置60℃水浴加熱10m in,冷卻后,取1m L,置10m L容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,注入色譜儀,記錄色譜圖,在兩性霉素B峰的相對(duì)保留主峰時(shí)間約為0.6倍處有一雜質(zhì)峰,理論板數(shù)按兩性霉素B峰計(jì)算不低于3 000。

    先以流動(dòng)相A洗脫,待兩性霉素B洗脫后,再按表1進(jìn)行線性梯度洗脫。精密量取對(duì)照溶液注入色譜儀,調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度,使主峰高約為滿量程的25%。

    表1 梯度洗脫表

    供試品溶液制備:取供試品25 mg,精密稱定,置50m L棕色容量瓶中,緩慢滴加二甲基亞砜(DMSO)并旋搖,使其均勻地分散在DMSO中,再加DMSO使其溶解并稀釋至刻度。精密量取2m L,置50 m L棕色容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻。制備1份,進(jìn)樣1針。

    對(duì)照溶液制備:精密量取供試品溶液2 m L,置100m L棕色容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻。制備1份,進(jìn)樣2針,RSD≤5.0%。

    精密量取供試品溶液和對(duì)照溶液,分別注入色譜儀,記錄色譜圖。

    計(jì)算如下:

    表2 第一次混合樹脂過柱條件及結(jié)果

    2.2 實(shí)驗(yàn)方法

    裝柱:不同比例的2種樹脂,濕法裝柱300 m L至600 mm×50 mm層析柱,柱內(nèi)保留過樹脂層10 cm的pH為3.8~4.2的流動(dòng)相吸附過程備用。

    樣品溶解:將10 g兩性霉素B置于比例為1:2的DMF和甲醇混合溶劑中,調(diào)pH至4.5,以50 r/min攪拌溶解,將溶解好的溶液放入18~20℃的恒溫水浴鍋中,保溫備用。

    吸附:將保溫后的兩性霉素B溶液(18~23℃),用恒流泵以15m L/min的速率注入層析柱內(nèi),10m L/m in的溶液速率過樹脂柱,總過柱時(shí)間為65~70m in,柱內(nèi)流動(dòng)相控制為pH至3.5~5.0。

    2.3 實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果

    2.3.1 第一次混合比例樹脂過柱

    以10 g兩性霉素B為溶解量,總樹脂量300m L,并分別以D832和D816 2種樹脂混合比例為3:7、4:6、5:5、6:4、7:3,在兩性霉素B溶解溫度為18~20℃、柱內(nèi)流動(dòng)相pH為3.8~4.2條件下,以10m L/m in的過柱速率吸附溶解液中的雜質(zhì)。

    2.3.2 第一次混合樹脂過柱條件及結(jié)果

    第一次混合樹脂過柱條件及結(jié)果如表2所示,第一次過柱后有關(guān)物質(zhì)曲線圖如圖1所示。從第一次混合比例樹脂結(jié)果數(shù)據(jù)及圖表可以看出,在其他吸附條件相同的條件下,當(dāng)樹脂混合比例趨向于D832:D816為4:6時(shí),樹脂吸附兩性霉素B雜質(zhì)的效果最優(yōu),產(chǎn)物最大單雜為1.59%,總雜為6.29%。因此,以D832:D816比例為4:6基礎(chǔ)進(jìn)行最佳吸附樹脂比例的細(xì)化研究。

    2.3.3 第二次混合比例樹脂過柱

    以10 g兩性霉素B為溶解量,總樹脂量300m L,并分別以D832和D816兩種樹脂混合比例為3.4:6.6、3.6:6.4、3.8:6.2、4.0:6.0、4.2:5.8、4.4:5.6、4.6:5.8,在兩性霉素B溶解溫度為18~20℃,柱內(nèi)流動(dòng)相pH為3.8~4.2條件下,以10m L/m in的過柱速率吸附溶解液中的雜質(zhì)。

    2.3.4 第二次混合樹脂過柱條件及結(jié)果

    第二次混合樹脂過柱條件及結(jié)果如表3所示,第二次過柱后有關(guān)物質(zhì)曲線圖如圖2所示。第二次混合比例樹脂過柱結(jié)果表明在D832:D816樹脂比為3.6:6.4的情況下,樹脂對(duì)兩性霉素B雜質(zhì)的吸附效果最好,最大單雜為1.45,總雜為5.60,較其他比例的混合樹脂吸附雜質(zhì)效果更加顯著。

    表3 第二次混合樹脂過柱條件及結(jié)果

    3 結(jié)語

    利用不同極性的大孔樹脂對(duì)兩性霉素B雜質(zhì)的特異性吸附作用,將不同種類的樹脂按最佳比例混合起來,有選擇性地吸附兩性霉素B溶解液中的雜質(zhì),此方法顯著地降低了兩性霉素B的有關(guān)物質(zhì),在很大程度上提高了兩性霉素B原料的質(zhì)量。

    [1]楊虹.抗深部真菌藥兩性霉素B的研究進(jìn)展.中國醫(yī)療前沿,2009,4(8):3~4

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    [6]李崇明,熊富民,黃志軍,等.新藥研究中大孔樹脂型號(hào)與規(guī)模的選擇應(yīng)用.中成藥,2008,30(8):1 208~1 210

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