Alcalase酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的研究

陳 合， 王 娟， 舒國偉， 張秋紅， 高麗嫚

(陜西科技大學 生命科學與工程學院， 陜西 西安 710021)

0 引言

心血管疾病以冠心病為主，冠心病又稱冠狀動脈硬化性心臟病，而高血壓是動脈粥樣硬化的重要危險因素，且血壓水平與心血管發(fā)病危險呈正相關(guān)[1].2010年中國高血壓防治指南指出，我國人群高血壓患病率仍呈增長態(tài)勢，每10個成人中就有2人患高血壓；估計目前全國高血壓患者至少2億.

目前有6 種主要的降壓藥物常用于抗高血壓藥物的治療，分別是利尿劑、α-受體拮抗劑、鈣通道阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑和α-腎上腺素受體阻滯劑.這些藥物雖然降壓效果顯著，但有毒副作用，如咳嗽、過敏性血管水腫及腎功能不全加重等[2].

有研究報道將食物蛋白質(zhì)進行水解后形成的小分子多肽，即血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽，具有顯著的降血壓作用，與普通降壓藥物比較無毒副作用，且對正常的血壓無影響[3].

目前用于研究ACE 抑制肽的食物來源主要有乳蛋白、魚蛋白、植物蛋白、發(fā)酵食品及天然ACE抑制肽.姜瞻梅等[4]利用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、As.1398中性蛋白酶和Alcalase 5 種蛋白酶對牛乳酪蛋白水解，均得到了具有降血壓作用的ACE抑制肽.

陜西是我國羊奶生產(chǎn)大省，奶山羊的存欄數(shù)、產(chǎn)奶量均居全國第一位.但羊乳產(chǎn)品品種少，僅限于羊奶粉、液態(tài)羊奶及大包裝工業(yè)羊奶粉，產(chǎn)品科技含量不高，附加值低，因此開發(fā)功能性羊乳制品很有必要.本研究采用單因素方法，考察了溫度、pH、酶添加量、底物濃度以及反應(yīng)時間對Alcalase酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽中水解度及ACE抑制率的影響.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與主要試劑

全脂羊奶粉 陜西紅星乳業(yè)有限公司；Alcalase、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)及Hip-His-Leu(HHL) 美國Sigma公司；乙酸乙酯 天津市天力化學試劑有限公司；硼酸 天津市登峰化學試劑廠；四硼酸鈉(硼砂)天津市紅巖化學試劑廠；鹽酸 北京化工廠；氫氧化鈉 西安化學試劑廠.

1.1.2 主要儀器設(shè)備

PHS-3C型酸度計上海精科儀器公司；78-1磁力加熱攪拌器江蘇省金壇市正基儀器有限公司；UV-5300PC型紫外分光光度計上海元析儀器有限公司；Q2-901型旋渦混合儀海門市其林貝爾儀器制造有限公司；FD-1D-50型真空冷凍干燥機北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；TG16A-WS型臺式高速離心機湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司；離心機 北京時代比利離心機有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 酪蛋白的制備

稱取一定量的羊奶粉，按照 1∶9(重量/體積)加入蒸餾水配成羊乳，再經(jīng)高速離心機 6 400 r/min離心15 min，制得脫脂乳.用1 mol/L HCL調(diào) pH 至4.5，使酪蛋白沉淀, 6 400 r/min離心15 min，將沉淀與乳清分開，用蒸餾水反復洗滌酪蛋白沉淀，使其pH為7，離心分離得到沉淀，將沉淀預凍一定時間，冷凍干燥 24 h后備用.

1.2.2 ACE抑制肽的制備

精確稱取一定量的酪蛋白，用熱水溶解，置于溫水浴鍋中，待反應(yīng)體系溫度達到水解溫度，加入HCL或NaOH，調(diào)節(jié)pH為酶最適pH.加入一定量的Alcalase酶水解，在水解過程中不斷的攪拌，并不斷的加入適量濃度的NaOH以維持pH值保持不變，記錄加堿量和時間.到預定時間后，將反應(yīng)體系在90 ℃水浴中保溫10 min，終止反應(yīng).將水解物調(diào)節(jié) pH=3.4～3.6后在5 000 r/min離心15 min，取上清液至管制瓶中調(diào)節(jié)pH=8.3，5 000 r/min再次離心15 min，取上清液備用.

1.3 測定方法

1.3.1 水解度的測定[5]

水解度的測定按照pH-STAT 法，計算公式為：

水解度DH%=(B×Mb)/(α×Mp×8.2)

公式中：B：NaOH的體積(mL)；Mb：NaOH 的濃度(mol/L)；1/α：酪蛋白水解反應(yīng)的解離度的倒數(shù)；Mp：蛋白質(zhì)的質(zhì)量(g)；8.2：每克原料蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)(mmol)，對于酪蛋白，該值取8.2.

1.3.2 ACE抑制活性的體外檢測[6]

此測定方法采用Cushman和Cheung的方法根據(jù)具體情況對反應(yīng)體系的大小、乙酸乙酯的萃取量、離心速度等進行了一定改進.

表1 ACE抑制率檢測方法

據(jù)表1所示，將各試劑加入試管，于37 ℃水浴中反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后加入1 mol/L HCl終止反應(yīng)，再加入乙酸乙酯1.7 mL，震蕩15 s，靜置5 min，取1 mL乙酸乙酯層，120 ℃烘箱30 min蒸干，冷卻后重新溶解于3 mL去離子水中，波長228 nm處測定吸光度，由下式計算ACE抑制率：

ACE抑制率%=(Ab-Aa)/(Ab-Ac)×100%

式中：Ab為反應(yīng)中不加ACE抑制劑的吸光度；Aa為反應(yīng)中ACE抑制劑和ACE同時存在的吸光度；Ac是ACE和HHL空白反應(yīng)的吸光度.

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對Alcalase水解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的影響

選定底物濃度10%，E/S5%，pH7.5條件下分別于45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃下水解2 h，結(jié)束后滴加0.1 mol/L NaOH至pH到7.5，計算水解度，取樣4 mL，紫外分光光度法測定ACE抑制率，結(jié)果如圖1所示.

圖1 溫度對Alcalase水解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的影響

由圖1可知，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，水解度逐漸增大，50 ℃時達最大，升到一定溫度后水解度逐漸降低，而抑制率的變化不與水解度同步，沒有固定的規(guī)律性，呈現(xiàn)出升高降低又升高的趨勢，55 ℃時達最大，此時ACE抑制率和水解度分別為87.45%及11.2%.表明并非水解度越高，ACE抑制率越高，因為50 ℃時酪蛋白深度水解，破壞了已經(jīng)產(chǎn)生的ACE抑制肽，導致ACE抑制率的降低.需將水解度控制在適當?shù)乃?，選擇55 ℃為水解溫度.

2.2 pH對Alcalase水解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的影響

選定底物濃度10%，E/S5%，55 ℃條件下，分別于pH為6.5、7、7.5、8、8.5下水解2 h，測定對應(yīng)pH下的水解度及酪蛋白水解液的ACE抑制率，結(jié)果如圖2所示.

由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，隨pH值的升高，水解度不斷升高，pH7.5時水解度達最大值，此后，隨著pH值的繼續(xù)升高，水解度開始減小，而ACE抑制率的變化不與水解度同步，呈現(xiàn)出增大減小又增大的趨勢，在pH為7.0時取得最大值，ACE抑制率和水解度分別為88.4%及6.06%.洪偉[7]等人研究了Alcalase水解牛乳酪蛋白制備ACE抑制肽，發(fā)現(xiàn)在pH 7.5時，ACE抑制率達到了最大，說明Alcalase作用于牛乳與羊乳酪蛋白時，最適pH有差異.

2.3 酶添加量對Alcalase水解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的影響

選定底物濃度10%，pH7.5，溫度T 55 ℃條件下，分別于酶添加量E/S為3%、4%、5%、6%、7%時水解2 h，測定對應(yīng)E/S時的水解度和ACE抑制率，結(jié)果如圖3所示.

圖3 E/S對Alcalase水解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的影響

由圖3可知，隨著E/S的增加，水解度不斷增大，最后幾乎趨于不變，而抑制率的變化趨勢不與水解度同步，大致呈現(xiàn)出增大又減小的趨勢，在E/S為5%時，酪蛋白水解液的ACE抑制率達到最大，ACE抑制率和水解度分別為87.27%及11.3%.其原因在于水解初產(chǎn)生的ACE 抑制肽與酶分子結(jié)合后，又與底物結(jié)合，形成了抑制劑-酶-底物的三元復合物，酶分子不再催化底物反應(yīng)，形成了非競爭性抑制.

2.4 底物濃度對Alcalase水解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的影響

選定pH7.5，溫度55 ℃，E/S5%，分別在底物濃度為2%、4%、6%、8%、10%和12%時水解2 h，測定對應(yīng)底物濃度時的水解度和ACE抑制率，結(jié)果如圖4所示.

圖4 底物濃度對Alcalase水解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的影響

由圖4可知，隨著底物濃度的增加，水解度不斷升高，最后幾乎趨于不變，而抑制率的變化大致呈先增大后減小的趨勢，在底物濃度為10%時，酪蛋白水解液的ACE抑制率達到最大，ACE抑制率和水解度分別為86.8%及12.82%.表明水解初期，底物濃度大，有利于水解，水解度及ACE抑制率迅速增大.

2.5 水解時間對Alcalase水解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的影響

選定底物濃度10%，E/S5%，pH7.5，溫度55 ℃條件下，分別將酪蛋白在Alcalase酶作用下水解30、60、90、120、150、180、210、240 min，測定不同時間下的水解度和ACE抑制率，結(jié)果如圖5所示.

圖5 水解時間對Alcalase水解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的影響

由圖5可知，隨著水解時間的增加，水解度不斷升高，最后幾乎趨于不變，而抑制率的變化大致呈先增大后減小的趨勢，水解到120 min時，酪蛋白水解液的ACE抑制率達到最大，ACE抑制率和水解度分別為89.09%及18.91%.表明水解前120 min，酪蛋白水解較為充分，生成了大量的ACE抑制肽，120 min后，水解度基本不變，而ACE抑制率迅速減小.

3 結(jié)論

研究了Alcalase 酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的影響因素，確定了最佳的酶解條件為：溫度55 ℃、pH 7.0、酶添加量E/S5%、底物濃度10%、水解時間120 min.為Alcalase水解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽提供了理論參考和技術(shù)支撐，對開發(fā)陜西羊乳資源、提高羊乳制品的功效和附加值、豐富羊乳的花色品種有重要意義.

[1] 王佳佳,胡志和.乳源ACE抑制肽的制備及應(yīng)用[J].食品科學,2012,33(3)：286-291.

[2] Jing Bo Liu,Zhi Peng Yu,Wen Zhu Zhao,et al.Isolation and identification of angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides from egg white protein hydrolysates[J].Food Chemistry,2010，122:1 159-1 163.

[3] Fazheng Ren,Shunliang Zhang,Huiyuan Guo,et al.Systemic screening of milk protein-derived ACE inhibitors through a chemically synthesised tripeptide library[J].Food Chemistry,2011，128:761-768.

[4] 姜瞻梅,田 波,吳 剛,等.酶解牛乳酪蛋白制備ACE 抑制肽的研究[J].中國食品學報,2007,7(6):39-43.

[5] 王海燕.發(fā)酵乳中降血壓產(chǎn)品的制備工藝[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學，2002.

[6] 姜瞻梅,吳 剛,劉麗波,等.酪蛋白源降血壓肽穩(wěn)定性及其抑制作用機理的研究[J].食品科學,2008,29(4):249-252.

[7] 洪 偉，薛正蓮，陳 玲.酪蛋白制備ACE抑制肽的酶解工藝優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵科技,2010,46(2):37-40.