單核細(xì)胞增生性李斯特菌生物被膜形成調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

張 輝，崔煥忠，鄭 鑫

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，吉林 長春130118）

單核細(xì)胞增生性李斯特菌（Listeriamonocytogenes，LM）是重要的人獸共患食源性病原菌，可引起人、多種動物感染發(fā)病，病死率高達(dá)20%～30%。近年來，李斯特菌病在世界范圍內(nèi)都有發(fā)生，并且發(fā)病具有上升趨勢。由于該菌在自然界中廣泛存在，并可形成生物被膜，增強(qiáng)了該菌對外界環(huán)境的抵抗力。李斯特菌病的發(fā)生80%是由生物被膜引起，由于生物被膜的多重耐藥性，給臨床治療帶來巨大困難［1］，嚴(yán)重的危害了人們健康，影響畜牧業(yè)發(fā)展。深入了解生物被膜形成調(diào)控機(jī)制，將有助于尋找生物被膜形成的抑制劑，降低人和動物感染發(fā)病的幾率［2］。

生物被膜（biofilm，簡稱BF）的概念最初是由加拿大微生物學(xué)家J.William Costerton提出來的，是指細(xì)菌粘附于接觸表面，分泌胞外多聚物，將自身包繞而形成的微生物群落。細(xì)菌生物被膜形成及成熟過程涉及復(fù)雜的細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，目前證實有3種信號分子參與機(jī)制的調(diào)節(jié)。革蘭陰性菌具有?；呓z氨酸內(nèi)酯自身誘導(dǎo)劑，革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均具有自身誘導(dǎo)劑2（Autoinducer－2，AI－2），AI－2是惟一一個在革蘭陽性菌與陰性菌中同時存在的群感效應(yīng)系統(tǒng)，而革蘭陽性菌則利用縮氨酸介導(dǎo)的信號通路進(jìn)行信號調(diào)節(jié)［3］。

1 正向調(diào)控機(jī)制

1.1 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子PrfA對生物被膜形成的調(diào)控PrfA是正向調(diào)控生物被膜形成的因子之一。研究發(fā)現(xiàn)與野生型菌株EGD相比，PrfA基因突變菌株（ΔPrfA）形成生物被膜的能力明顯降低，倒置顯微鏡下觀察到EGD株能形成致密的鏈網(wǎng)狀膜結(jié)構(gòu)，交聯(lián)度較高，而ΔPrfA株形成的鏈網(wǎng)狀膜結(jié)構(gòu)相對比較疏松，交聯(lián)度稍低。統(tǒng)計分析表明，EGD株與無害李斯特菌之間形成生物被膜的差異顯著。而無害李斯特菌幾乎沒有成型的鏈網(wǎng)狀膜結(jié)構(gòu)形成，暗示生物被膜的形成可能與LM的致病性有關(guān)［4］。

PrfA蛋白是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子CRP－FNR家族的成員之一，小分子輔助因子調(diào)控許多家族成員蛋白的活性狀態(tài)［5］。利用點突變構(gòu)建兩個基因突變菌株，研究其對生物被膜形成的影響。在基因突變菌株prfA＊中，變異PrfA蛋白的功能被限定在細(xì)胞內(nèi)活力狀態(tài)，即在宿主細(xì)胞漿內(nèi)能夠持續(xù)表達(dá)毒力因子ActA蛋白，并可通過激活PplcA，增加PrfA蛋白的表達(dá)；而在基因突變菌株P(guān)rfA（Y154C）中，變異的PrfA蛋白不能完全轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)活力狀態(tài)，即在胞內(nèi)感染階段不能正向調(diào)控ActA蛋白表達(dá)，雖然可以進(jìn)入宿主細(xì)胞漿但是不能完成細(xì)胞間的擴(kuò)散。prfA＊在室溫和30℃下形成的生物被膜量與野生型相同，但是在36℃下比野生型要少。PrfA（Y154C）在30℃和36℃下形成生物被膜的量均增加，但是在室溫下與野生型菌相同。不能完全轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)活力狀態(tài)的突變菌株有利于生物被膜的形成，生物被膜形成能力的增加可能是由于PrfA蛋白變構(gòu)調(diào)節(jié)的結(jié)果［4］。

1.2 DegU LM具有17個編碼二組分系統(tǒng)的基因簇，枯草桿菌DegS/DegU系統(tǒng)在控制細(xì)菌靜止期適應(yīng)性反應(yīng)方面起著重要作用［6］。研究表明LM不存在DegS激酶的同源基因，但具有DegU（降解酶調(diào)節(jié)因子）反應(yīng)調(diào)節(jié)同系物，DegU作為孤立的反應(yīng)調(diào)節(jié)器，在調(diào)控細(xì)菌一些重要的適應(yīng)性反應(yīng)方面發(fā)揮著重要的作用［7］。滅活DegU基因表明，DegU通過直接與DegU基因啟動子區(qū)結(jié)合，從而負(fù)調(diào)控自身合成。DegU基因與其下游的yviA基因共轉(zhuǎn)錄。DegU為LM鞭毛合成及細(xì)菌運動性所必需，也是細(xì)菌在高溫條件下生長，粘附到塑料表面并有效形成生物被膜所需要的因子［8］。

1.3 Agr操縱子 Agr操縱子可以調(diào)控毒力因子的表達(dá)，并與生物被膜的形成相關(guān)。Agr操縱子為LM的群感效應(yīng)系統(tǒng)，正向調(diào)控生物被膜的形成［9］。Agr操縱子包括agrB、agrD、agrC和agrA四個因子，Aurélie等分別構(gòu)建了agrA和agrD框內(nèi)缺失菌株，研究了Agr操縱子對生物被膜形成的影響，結(jié)果表明，基因缺失菌株ΔagrA和ΔagrD對玻璃片的粘附能力均顯著降低，表明Agr操縱子參與生物被膜形成的粘附過程。在生物被膜形成的早期，突變體ΔagrA和ΔagrD在聚苯乙烯上形成生物被膜的能力明顯低于親本菌株［10］。agrA和agrD雙基因缺失菌株對靜止或動態(tài)培養(yǎng)LM生物被膜的形成都有影響。Agr操縱子可以直接調(diào)控生物被膜形成，還可通過調(diào)控LM毒力因子的表達(dá)間接調(diào)生物被膜形成［11］。

1.4 其他正向調(diào)控因子 壓力調(diào)控因子sigma B與LM生物被膜的形成有關(guān)，張強(qiáng)等比較了EGD、基因缺失菌株Δsigma B以及無害李斯特菌生物被膜的形成能力，結(jié)果表明3種菌株形成生物被膜的能力具有一定的差異，暗示sigma B對生物被膜的形成具有一定的影響［12］。

LM的胞外DNA是細(xì)菌最初粘附和生物被膜形成的必要物質(zhì)，胞外DNA通過某種特定的方式與肽聚糖的N－乙酰葡萄糖氨相互作用，參與生物被膜形成的粘附過程，這種粘附過程需要高分子質(zhì)量的DNA參與，而且細(xì)菌表面的粘附位點可以被DNA 飽和［13］。

LM需要借助鞭毛的趨化運動使浮游的細(xì)菌向有營養(yǎng)物質(zhì)的表面游動，并克服表面張力到達(dá)并粘附到物體表面，使粘附的細(xì)菌個體從載體表面播散出去，與細(xì)菌的胞外基質(zhì)相互作用，在生物被膜中起橋梁作用，形成穩(wěn)定生物被膜結(jié)構(gòu)［14－15］。

2 負(fù)向分子調(diào)控機(jī)制

2.1 ABC轉(zhuǎn)輸通透酶對生物被膜形成的調(diào)控Zhu等采用轉(zhuǎn)座子誘變構(gòu)建基因缺失菌株，該基因缺失菌株Δ1771形成生物被膜能力增強(qiáng)，lm.G_1771基因可能編碼ABC轉(zhuǎn)運通透酶，表明ABC轉(zhuǎn)輸通透酶負(fù)調(diào)控生物被膜的形成［16］。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明，lm.G_1771基因通過調(diào)節(jié)編碼Dlt表面蛋白、細(xì)胞表面錨定蛋白SrtA以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子GntR等參與生物被膜形成的候選基因來調(diào)控生物被膜的形成?；蛉笔Ь軎?771對曲拉通－100敏感性和陽離子抗生素增加。dlt基因參與將丙氨酸殘基合并為脂磷壁酸過程，由于基因缺失菌株Δ1771中Dlt操縱子基因的下調(diào)，導(dǎo)致磷壁酸表面帶正電荷，使突變菌株對陽離子抗生素的抵抗力降低［17］。通過同源重組獲得的回復(fù)體形成生物被膜的量與野生型菌株相同。

2.2 luxS對生物被膜形成的調(diào)控luxS基因編碼S－核糖基高半胱氨酸酶，該酶可將S－核糖基高半胱氨酸（S－ribosyl homocysteine，SRH）催化水解為高半胱氨酸和4，5－二羥基－2，3－戊二酮（DPD），DPD經(jīng)過化學(xué)修飾形成自身誘導(dǎo)物－2（AI－2），AI－2是細(xì)菌種間信息傳遞的因子。luxS參與多種致病菌生物被膜的形成［18］。研究發(fā)現(xiàn)，luxS基因缺失菌株的粘附能力比親本菌株高19倍，并且形成生物被膜的量也相應(yīng)增加。但是外源的AI－2不能使突變菌株恢復(fù)野生型表型，推斷l(xiāng)uxS基因可能通過三維復(fù)合構(gòu)造參與抑制細(xì)胞粘附及生物被膜的形成過程，這一調(diào)控機(jī)制與可能 AI－2無關(guān)。Challan等［19］通過比較luxS基因缺失菌株與EDG株之間的浮游生長、浮游運動性、磷脂酶活性、溶血活性以及生物被膜形成的差異，研究luxS對生物被膜形成的調(diào)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，連續(xù)培養(yǎng)48h，luxS基因缺失菌株形成生物被膜的密度比野生型菌株EDG高17倍，并且在細(xì)菌培養(yǎng)上清液中S－腺苷高半胱氨酸（S－adenosyl homocysteine，SAH）和SRH的含量均高于親本菌株，并證實了生物被膜的形成與AI－2和SAH無關(guān)，而是通過SRH調(diào)節(jié)粘附細(xì)胞的數(shù)量，調(diào)控生物被膜的形成，但是其確切調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

3 理化因素對生物被膜形成的影響

生物被膜的形成受營養(yǎng)條件、溫度、生長環(huán)境及粘附材料種類等因素的影響［20］。Begley等［21］發(fā)現(xiàn)，在膽汁的存在下，細(xì)菌通過調(diào)整多種代謝途徑來加快其生長速度，增強(qiáng)生物被膜的形成能力。劉彤等［22］研究了溫度對生物被膜形成的影響，結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)溫度下降生物被膜形成顯著減少。添加適量的葡萄糖可以提高形成生物被膜的能力，表明富含營養(yǎng)的環(huán)境有利于LM形成生物被膜［23］。低濃度的NaCl（低于0.5%）可促進(jìn)生物被膜的形成，高濃度NaCl則會抑制生物被膜的形成。

4 問題與展望

生物被膜的形成受調(diào)控因子的調(diào)控，目前對LM生物被膜形成相關(guān)調(diào)控因子的研究，主要是發(fā)現(xiàn)未知的與生物被膜形成相關(guān)的基因以及驗證一些已知功能基因在其生物被膜形成中的作用［24］。而有關(guān)調(diào)控生物被膜形成的確切分子機(jī)制以及生物被膜分子間信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面的研究還不是非常深入，因此今后研究方向應(yīng)集中于生物膜形成分子調(diào)節(jié)機(jī)制、相關(guān)基因之間的表達(dá)調(diào)控，以及一些控制技術(shù)領(lǐng)域。詳細(xì)了解生物被膜形成的機(jī)制，對于尋找生物被膜形成抑制劑，以及有效地控制生物被膜的形成具有重要意義。

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