時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)在真菌毒素檢測的應(yīng)用①

王 坤 侯玉澤 胡驍飛 王 耀 李文君 裴亞峰 鄧瑞廣

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，洛陽471003)

近些年，生物標(biāo)記技術(shù)不斷的發(fā)展，免疫分析技術(shù)得到了快速的發(fā)展。例如放射免疫分析技術(shù)，由于放射分析技術(shù)存在污染性和局限性，限制其進(jìn)一步發(fā)展與應(yīng)用，繼由放射免疫分析技術(shù)之后，又研究形成了各種非放射免疫技術(shù)，包括酶標(biāo)記分析技術(shù)、熒光免疫分析技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)、時(shí)間分辨熒光免疫分析(Time-resolved fluoreimmuoassay，TRFIA)技術(shù)等。但是，從靈敏度上來說只有TRFIA技術(shù)可與放射免疫分析媲美。TRFIA是20世紀(jì)80年代迅速發(fā)展起來的一種被公認(rèn)為最有發(fā)展前途的一種非放射標(biāo)記分析技術(shù)[1]。

1 TRFIA的技術(shù)原理和優(yōu)勢

1.1 TRFIA的技術(shù)原理 TRFIA是用具有特殊熒光的鑭系離子與螯合劑結(jié)合作為示蹤物標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽、激素、抗體等，在一定的反應(yīng)體系(如:抗原抗體免疫反應(yīng)、生物素親和素反應(yīng)、核酸探針雜交反應(yīng)、靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞的殺傷反應(yīng)等)發(fā)生反應(yīng)后，用時(shí)間分辨熒光儀測定產(chǎn)物中的特異熒光強(qiáng)度，推測反應(yīng)體系中分析物的濃度，從而達(dá)到對待測物質(zhì)進(jìn)行定量分析的目的[2，3]。

1.2 TRFIA的優(yōu)勢 TRFIA技術(shù)具有酶標(biāo)記分析技術(shù)和同位素標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn):具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，且測定范圍寬，試劑壽命長，操作簡便和非放射性等特點(diǎn)[4]。優(yōu)勢有以下幾點(diǎn):

一般熒光物質(zhì)光譜的Stokes位移非常的小，只有幾十納米[5]，導(dǎo)致激發(fā)光譜和發(fā)射光譜通常有部分重疊，互相干擾嚴(yán)重。但是鑭系離子與螯合劑形成螯合物后，Stokes位移能夠達(dá)到200 nm以上，很容易分辨激發(fā)光和發(fā)射光，從而激發(fā)光干擾就可以排除了。

鑭系元素與通常的熒光物質(zhì)相比較，鑭系元素離子螯合物熒光的衰變時(shí)間要長的多，為傳統(tǒng)熒光的103～106倍。在用時(shí)間分辨熒光儀測量熒光時(shí)，可以適當(dāng)?shù)难舆t一段時(shí)間，待其它物質(zhì)的熒光衰變后再測量，這時(shí)只測量Eu3+標(biāo)記物的特異性熒光，即通過TRFIA技術(shù)，極大地降低了本底熒光，這是TRFIA高靈敏度和低干擾的原因之一[6]。

鑭系螯合物激發(fā)光光譜比較寬，通常在300～500 nm，可通過增加激發(fā)光能量來提高靈敏度。而它的發(fā)射光譜帶很窄，甚至不到10 nm，可采用只允許發(fā)射熒光通過的濾光片，進(jìn)一步降低本底熒光，這樣可以大大的提高檢測的靈敏度。

鑭系離子與雙功能螯合劑螯合后，可形成穩(wěn)定的螯合物，穩(wěn)定性非常高，生產(chǎn)出的產(chǎn)品保質(zhì)期可以長達(dá)2年。而酶標(biāo)記物常因其純度、顯色底物不穩(wěn)定等問題，使其應(yīng)用受到限制。再者，Eu3+標(biāo)記物體積很小(為原子標(biāo)記)，標(biāo)記后不會影響被標(biāo)記物的空間立體結(jié)構(gòu)，這既保證了被檢測物質(zhì)的穩(wěn)定性(尤其對蛋白質(zhì)影響更小)，又可實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)標(biāo)記，這樣可以實(shí)現(xiàn)一個(gè)試劑盒能夠同時(shí)檢測出兩種或兩種以上的物質(zhì)，這樣不但簡便還大大降低了成本。

2 時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)(TRFIA)在真菌毒素檢測方面的應(yīng)用

真菌毒素(M ycotoxins)是由產(chǎn)毒真菌(主要為曲霉屬、青霉屬及鐮孢屬)在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)生的具有很強(qiáng)毒性的二級代謝產(chǎn)物，它主要對食品、農(nóng)作物及飼料等污染很嚴(yán)重[7]。真菌毒素大約每年會污染將近25%的農(nóng)產(chǎn)品，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)這些被污染的農(nóng)產(chǎn)品被人和動物攝入后會產(chǎn)生很多種疾病，嚴(yán)重威脅著人類與動物的生命與健康[8]。當(dāng)前，最主要的真菌毒素主要有:黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬菌素、T-2毒素、展青霉素、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等。

在當(dāng)今世界上，食品安全和糧食安全問題已經(jīng)成為我們?nèi)粘Ｉ铌P(guān)注的焦點(diǎn)問題之一。對真菌毒素限制正在逐步加強(qiáng)，限量標(biāo)準(zhǔn)也在不斷降低，所以更需要找到一種靈敏度高，特異性強(qiáng)，簡便快速容易普及應(yīng)用的方法來檢測真菌毒素。目前，真菌毒素的測定方法有TLC法、HPLC法[9]等，這些方法都不同程度地存在著樣品前處理過程復(fù)雜、毒性大、所需時(shí)間長等缺點(diǎn)。由于其他熒光物質(zhì)、色素、結(jié)構(gòu)類似物對檢測產(chǎn)生干擾，必須通過液-液萃取進(jìn)行凈化處理，操作煩瑣，有機(jī)試劑用量大，提取效率低，環(huán)境污染嚴(yán)重。ELISA法靈敏、且快速、低成本，但ELISA是一種定性或半定量的方法，當(dāng)選擇的不同單克隆抗體，會造成結(jié)果存在一定的誤差，所以這種定量，相對不太準(zhǔn)確。TRFIA具有排除其他熒光干擾，靈敏度高，一次可以測多個(gè)樣品的優(yōu)勢，將成為檢測真菌毒素的主要方法。

2.1 黃曲霉毒素

2.1.1 黃曲霉毒素的性質(zhì)、危害及限量標(biāo)準(zhǔn) 黃曲霉毒素(Aflatoxin，AF)由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)劃定為Ⅰ類致癌物，主要作用于肝臟[10]。由于黃曲霉毒素的危害性比較大和分布比較廣泛，聯(lián)合國的相關(guān)組織(像WHO、FAO、UNEP等)曾多次組織調(diào)研并提出了對應(yīng)的控制措施和標(biāo)準(zhǔn)。在1995年世界衛(wèi)生組織規(guī)定了食品中AFB1的含量不能超過15 μg/kg，在嬰兒食品中不能檢出[11];美國聯(lián)邦政府也出臺了相關(guān)法律，規(guī)定了食品和飼料中總的黃曲霉毒素含量不得超過15 μg/kg;歐盟國家的規(guī)定更加的嚴(yán)格，規(guī)定了日常生活食用品中的AFB1的含量不得超過2 μg/kg，總量不超過4 μg/kg，最近已將部分食品中的AFB1的含量限定在0.1 μg/kg以內(nèi)。我國對AFB1的污染和控制也非常重視[12]，在1982年頒布了糧油和發(fā)酵食品中的AFB1允許量標(biāo)準(zhǔn)。規(guī)定大米、食用油中AFB1的含量不超過10 μg/kg，其他糧食、豆類及發(fā)酵食品的含量不能超過5 μg/kg。

2.1.2 AFB1-TRFIA檢測方法的建立 黃飚等[13]采用時(shí)間分辨熒光技術(shù)建立了高靈敏的黃曲霉毒素Bl(AFB1)間接競爭免疫分析法(AFB1-TRFIA)。該方法的靈敏度為0.01 μg/kg，測量范圍為0.01～100 μg/kg，批內(nèi)和批間的變異率為4.1%和6.8%，平均回收率為97.2%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ELISA試劑盒檢測。計(jì)融等[14]利用間接競爭ELISA方法，研制黃曲霉毒素ELISA檢測試劑盒。該試劑盒最低檢出濃度為 0.26 μg/kg，對樣品的最低檢出量為 1.5 μg/kg。采用AFB1-TRFIA技術(shù)檢測的靈敏度和測量寬度較ELISA結(jié)果都好，其靈敏度高，測量范圍很寬，這樣既可以符合食品中AFB1較低濃度的限量標(biāo)準(zhǔn)，也能夠符合飼料中AFB1較寬范圍的限量標(biāo)準(zhǔn)，是一種簡便、快速、經(jīng)濟(jì)的并可以進(jìn)行大批量樣品檢測的方法。黃飚等[15]又采用時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)，建立黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的高靈敏的TRFIA的檢測方法，并且研制出具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的快速、靈敏的AFB1-TRFIA、OTA-TRFIA檢測試劑盒。結(jié)果該方法檢測黃曲霉毒素B1的靈敏度為0.02 μg/L，測量范圍為0.02 ～100 μg/L，檢測赭曲霉毒素A的靈敏度為0.05 μg/L，測量范圍為0.05～50 μg/L，這種方法靈敏度高，穩(wěn)定性好，可測范圍寬，一次操作同時(shí)可以得到AFB1、OTA的兩個(gè)結(jié)果，是一種簡單、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定的檢測方法。

2.2 赭曲霉毒素

2.2.1 赭曲霉毒素的性質(zhì)、危害及限量標(biāo)準(zhǔn) 赭曲霉毒素(Ochratoxin，OT)是赭曲霉屬和青霉屬的幾種真菌分泌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。主要對農(nóng)作物、動物和人有毒害作用的物質(zhì)，其中以赭曲霉毒素A(OTA)毒性和危害是最大的，對農(nóng)作物的污染最嚴(yán)重、分布也是最廣泛的[16]。OTA主要毒害人和動物的腎臟及肝臟，有致畸、免疫抑制和致癌作用，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)IARC把它認(rèn)定為2B類致癌物，對農(nóng)作物、動物和人都有很大的毒害作用。因此各國對各類食品中OTA的限量標(biāo)準(zhǔn)很嚴(yán)格，如歐盟國家在谷物中不得超過5 μg/kg，在谷物制品中不得超過3 μg/kg，在干鮮果品中不得超過 10 μg/kg[17]。

2.2.2 OTA-TRFIA檢測方法的建立 黃飚等[18]采用稀土離子標(biāo)記技術(shù)，應(yīng)用多克隆抗體建立高靈敏的赭曲霉毒素A(OTA)時(shí)間分辨熒光免疫分析法(OTA-TRFIA)。以O(shè)TA-KLH為免疫原制備抗OTA抗體;OTA與BSA的聯(lián)結(jié)物(OTA-BSA)為固相抗原，與游離OTA共同競爭有限的兔抗OTA抗體;用Eu3+標(biāo)記的羊抗兔抗體。該方法的靈敏度為0.02 μg/L，測量范圍為0.02 μg/L ～400 μg/L，批內(nèi)和批間的變異率分別為2.6%和5.2%，平均回收率為95.8%，與赭曲霉毒素B對OTA的檢測有5.6%交叉反應(yīng)，而黃曲霉毒素B1及BSA則沒有交叉反應(yīng)。不同時(shí)間進(jìn)行的OTA-TRFIA的ED80、ED50、ED20效應(yīng)點(diǎn)值分別為 0.2 μg/L、1.0 μg/L 和 5.3 μg/L。試驗(yàn)研究表明，OTA-TRFIA是目前在OTA檢測中最靈敏和簡便的方法之一，該分析方法具有穩(wěn)定性好、可測范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，具有很好的應(yīng)用前景。

2.3 伏馬菌素

2.3.1 伏馬菌素的性質(zhì)、危害及限量標(biāo)準(zhǔn) 伏馬菌素(Fumonisin，F(xiàn)B)是一種霉菌毒素，是由串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme Sheld)產(chǎn)生的水溶性代謝產(chǎn)物。流行病學(xué)調(diào)查顯示人類食管癌與伏馬菌素污染有關(guān)，國際癌癥研究中心(IARC)把它劃分到2B組，即人類有可能致癌的物質(zhì)[19]。伏馬菌素分布廣泛且毒性較大，越來越受到人們的關(guān)注。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)公布的食用谷物中伏馬菌素的推薦最高限量為2 mg/kg[20]，歐盟公布不同飼料中伏馬菌素的推薦最高限量標(biāo)準(zhǔn)為5 mg/kg。

2.3.2 FB1-TRFIA檢測方法的建立 張玨等[21]利用稀土離子Eu3+-羊抗鼠IgG進(jìn)行示蹤檢測，建立伏馬毒素B1-時(shí)間分辨熒光免疫分析(FB1-TRFIA)并進(jìn)行方法學(xué)的考核。結(jié)果FB1-TRFIA檢測靈敏度為0.05 ng/ml，檢測范圍為 FB1:1.0 ～1 000 ng/ml，批內(nèi)、批間變異率均小于10%。添加回收實(shí)驗(yàn)表明玉米樣品中FB1批內(nèi)平均回收率為104.3%，批間平均回收率為100.7%。FB1與FB2有輕微交叉反應(yīng)，F(xiàn)B1不與赤霉毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、T-2等真菌毒素發(fā)生交叉反應(yīng)，方法特異性好。結(jié)論:FB1-TRFIA靈敏度高，檢測范圍寬，重復(fù)性、穩(wěn)定性好，是一種簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定、可進(jìn)行大批量樣品伏馬毒素篩查的檢測方法。

2.4 T-2毒素

2.4.1 T-2毒素的性質(zhì)、危害及限量標(biāo)準(zhǔn) T-2毒素(T-2 toxin)是單端孢霉烯族毒素之一，可由多種真菌產(chǎn)生，主要產(chǎn)生菌是鐮孢菌屬，如擬枝孢鐮刀菌、枝孢鐮刀菌等[22]。1973年聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)在日內(nèi)瓦召開的聯(lián)席會議上，把這類毒素同黃曲霉素一樣作為自然存在的最危險(xiǎn)的食品污染源。它分布范圍廣(尤其是玉米和小麥)、毒性強(qiáng)，且證明其與克山病和大骨節(jié)病有關(guān)[23]。以色列規(guī)定谷物飼料中T-2毒素不得超過100 ppb;我國《配合飼料中T-2毒素的允許量(GB 21693-2008)》規(guī)定，在豬、禽配合飼料中，T-2毒素的允許量必須≤1 mg/kg，即≤1 ppm(1 000 ppb)。

2.4.2 T-2-TRFIA檢測方法的建立 楊潤琳等[24]以時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)方法建立快速靈敏的T-2毒素的全自動檢測方法。采用T-2-BSA包被96孔板作為固相抗原，與游離的T-2競爭有限的抗T-2單克隆抗體，以Eu3+標(biāo)記的羊抗鼠抗體示蹤，采用間接競爭免疫分析方法在解離增強(qiáng)熒光免疫分析體系中建立T-2-TRFIA。同時(shí)對這一方法的穩(wěn)定性、靈敏度、回收率和特異性進(jìn)行考核。此方法靈敏度為0.2 μg/L，測量范圍0.2 ～500 μg/L，批內(nèi)變異為7.5%，批間變異為12.7%，平均回收率為89.6%。與赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1、牛血清白蛋白無交叉反應(yīng)。10條不同時(shí)間進(jìn)行的間接競爭T-2-TRFIA的效應(yīng)點(diǎn)均值ED80、ED50、ED20分別為 2.66、6.97、29.11 μg/L。本試驗(yàn)建立的間接T-2-TRFIA方法所需時(shí)間短，分析系統(tǒng)高度自動化，操作簡便，人為誤差低，穩(wěn)定性高，可測范圍廣，靈敏度高，適合于快速、簡便、大批量的樣品篩查。

2.5 玉米赤霉烯酮

2.5.1 玉米赤霉烯酮的性質(zhì)、危害及限量標(biāo)準(zhǔn) 玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)又叫F-2毒素，是由串珠鐮刀菌、粉紅鐮刀菌及三線鐮刀菌等鐮刀菌株產(chǎn)生的一種雌激素真菌毒素。研究表明，豬對玉米ZEN最為敏感。高劑量的ZEN還能引起人的雌激素水平升高，并產(chǎn)生相應(yīng)的生殖紊亂癥狀[25]。因此，各國政府相繼出臺制定出了ZEN在動物飼料和糧食中的最高限量[26]。澳大利亞規(guī)定谷物中的ZEN的含量不能超過50 ppb;意大利規(guī)定在谷物和谷類產(chǎn)品中ZEN的含量不能超過100 ppb;法國規(guī)定植物油和谷類當(dāng)中ZEN的含量必須低于200 ppb;歐盟規(guī)定仔豬日糧中ZEN的最高限量為100 ppb;我國《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)飼料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允許量(GB 13078.2-2006)》規(guī)定配合飼料和玉米中ZEN的最高限量為500 ppb。

2.5.2 ZEN-TRFIA檢測方法的建立 馬智鴻等[27]采用基于生物素(Biotin)-鏈霉親和素(Strepavidin)的時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)技術(shù)建立了快速靈敏的玉米赤霉烯酮(ZEN)檢測方法。以Strepavidin包被板條，加入生物素化的ZEN-BSA，結(jié)合在板條上的ZEN-BSA與標(biāo)準(zhǔn)/樣本中的游離ZEN共同競爭限量的抗ZEN單克隆抗體，用稀土離子Eu3+標(biāo)記的羊抗鼠IgG進(jìn)行示蹤，建立了間接競爭的ZEN-TRFIA。該方法的檢測靈敏度為0.2 ng/ml，測量范圍是0.2～200.0 ng/ml，批內(nèi)和批間變異率分別為5.7%和8.3%，平均回收率達(dá)到了91.1%。與玉米赤霉醇的平均交叉反應(yīng)為12.3%，與黃曲霉素B1、赭曲霉素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇均無交叉反應(yīng)，說明該方法的特異性非常好。試驗(yàn)中用到的試劑在4℃放6個(gè)月后各項(xiàng)檢測參數(shù)幾乎沒有變化，說明該方法穩(wěn)定性很好。ZEN-TRFIA具有測量準(zhǔn)確、檢測靈敏度高、檢測范圍寬、操作簡便、標(biāo)記物穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，適合于ZEN大量篩查的應(yīng)用。

2.6 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

2.6.1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的性質(zhì)、危害及限量標(biāo)準(zhǔn) 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是一種單菌孢霉烯族化合物，DON主要污染玉米、大麥、小麥等谷類作物及制品，對人畜有很強(qiáng)的毒性[28]，1993年國際癌癥研究中心(IARC)將DON列為第三類致癌物。因此，各國都對谷物及飼料中DON的含量制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，例如，美國FDA規(guī)定小麥及其制品中DON的含量不得超過1.0 mg/kg，飼料中 DON 不得超過 4.0 mg/kg[29]。我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB2761-2005規(guī)定在食用小麥及玉米中DON的限量為1 000 μg/kg，GB20833-2007規(guī)定豬飼料中DON的允許量為1 000 μg/kg;聯(lián)合國糧農(nóng)組織規(guī)定食用糧食中DON的含量必須＜1000 μg/kg。

2.6.2 DON-TRFIA檢測方法的建立 周彬等[30]利用抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)多克隆抗體，采用納米均相時(shí)間分辨熒光免疫法測定技術(shù)建立間接競爭DON-TRFIA定量檢測方法。方法:DON-BSA包被發(fā)光微粒，生物素化羊抗兔抗體與包被有鏈霉素的感光微粒共同構(gòu)成檢測試劑，優(yōu)化檢測各種條件并對檢測性能進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果:該方法的靈敏度為0.007 ng/ml，檢測范圍為 0.007 ～100 ng/ml，批內(nèi)批間變異系數(shù)均＜5%。不同樣品添加回收實(shí)驗(yàn):玉米、小麥、啤酒回收率分別為 84% ～110%、67% ～100%、74% ～100%。結(jié)論:納米均相時(shí)間分辨熒光免疫法測定DON是目前DON檢測中最靈敏的方法之一，該分析方法穩(wěn)定性好，可測范圍寬，具有很好的應(yīng)用前景。

3 結(jié)語

綜上所述，真菌毒素是一類毒性很強(qiáng)的小分子物質(zhì)，性質(zhì)非常穩(wěn)定，不會因?yàn)樵诩訜岬那闆r下被破壞，并且對農(nóng)作物、飼料和食品污染很嚴(yán)重，這些都與我們?nèi)粘Ｉ詈蜕】涤蟹浅４蟮年P(guān)聯(lián)，也對畜禽的生長和肉類產(chǎn)品有重大的影響。對人畜的危害性主要表現(xiàn)在導(dǎo)致各種急性、慢性中毒現(xiàn)象的發(fā)生，而且還存在致癌、致畸、致突變的危險(xiǎn)。隨著人們生活水平的日益提高，解決真菌毒素可能造成的污染不僅關(guān)系到食品安全和人們的健康，而且還關(guān)系到畜禽肉類產(chǎn)品的健康發(fā)展。真菌毒素對人類生活的污染往往不易被人們所注意，因此更需要找到一種靈敏度高，特異性強(qiáng)，簡便快速容易普及應(yīng)用的方法來檢測真菌毒素。TRFIA技術(shù)是近些年新興起的一種快速免疫檢測技術(shù)，它集合了酶標(biāo)記技術(shù)、放射標(biāo)記技術(shù)和同位素標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有靈敏度高、特異性很強(qiáng)、穩(wěn)定性好，且測定范圍更寬，試劑盒壽命長，操作簡單和非放射性等特點(diǎn)，非常適用于真菌毒素的超微量分析，是一項(xiàng)很有前途的、值得推廣使用的技術(shù)，其應(yīng)用范圍不斷發(fā)展已經(jīng)成為食品安全檢測方面的重要手段。

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