銀杏中種皮化學成分的分離及鑒定

周桂生，姚 鑫，唐于平，①，錢大瑋，秦 勇，段金廒

(1.南京中醫(yī)藥大學江蘇省方劑高技術研究重點實驗室，江蘇南京210023;2.江蘇神龍藥業(yè)有限公司，江蘇鹽城224200)

銀杏(Ginkgo biloba Linn.)在中國種植廣泛，其產量占全世界總產量的70%［1］。中藥白果仁是銀杏種子去除肉質外種皮和骨質中種皮后得到的，具有斂肺定喘、止帶縮尿的功效。目前，有關銀杏種子的研究主要集中在具有藥食同源的白果仁［2］及具有潛在應用價值的外種皮［3］上，鮮見對銀杏種子中種皮的研究報道。生產中大量的銀杏中種皮被廢棄，因此，開展銀杏中種皮的相關研究對于充分利用該類資源非常必要。鑒于此，作者對銀杏中種皮的化學成分進行了系統(tǒng)分析，以期為其開發(fā)應用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試銀杏中種皮于2010年11月采自江蘇泰州銀杏基地，由本校藥用植物學教研室嚴輝鑒定，憑證標本保存于江蘇省方劑研究重點實驗室標本室，標本號BGZ－20101120。

主要儀器有Bruker Avance AV－500/300核磁共振儀(德國Bruker公司)、RE－852旋轉蒸發(fā)儀(南京金正教學儀器有限公司)和Waters 2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)。銀杏內酯B和銀杏內酯C對照品均購自中國藥品生物制品檢定所(批號分別為110863－201209 和110863－201105);β－谷甾醇和胡蘿卜苷對照品由本實驗室自制，純度均在98%以上。

1.2 方法

取干燥的銀杏中種皮7.5 kg，粉碎后用75 L體積分數(shù)95%乙醇回流提取2 h，同法提取2次;合并提取液，過濾后減壓濃縮至無醇味;用水混懸后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取6次，每次7.5 L;合并萃取液，回收溶劑后分別得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物25、30、50和200 g。

用硅膠柱對石油醚萃取物進行分離，用V∶V=100∶0～1∶1的石油醚－乙酸乙酯混合液梯度洗脫，洗脫物經純化后得到化合物Ⅰ (30 mg)、Ⅱ (55 mg)、Ⅲ (40 mg)、Ⅳ (60 mg)、Ⅴ (10 mg)、Ⅵ (20 mg)、Ⅶ (8 mg)、Ⅷ (10 mg)和Ⅸ (10 mg)。

采用硅膠柱對乙酸乙酯萃取物進行分離，并使用V∶V∶V=10 ∶1∶0 ～0∶3∶1 的石油醚－乙酸乙酯－甲醇混合液梯度洗脫，洗脫物經純化后得到化合物Ⅸ(8 mg)、Ⅹ(15 mg)、Ⅺ(12 mg)、Ⅻ (18 mg)、ⅩⅢ (20 mg)、ⅩⅣ (11 mg)、ⅩⅤ (15 mg)、ⅩⅥ(8 mg)、ⅩⅦ (22 mg)和ⅩⅧ (30 mg)。

采用硅膠柱反復對正丁醇萃取物進行分離，并使用V∶V=50∶1～1∶1的乙酸乙酯－甲醇混合液進行梯度洗脫，洗脫物經純化后得到化合物ⅩⅧ(100 mg)。

采用MS和NMR等方法并根據(jù)化合物的理化性質，結合相關文獻，對化合物Ⅰ～ⅩⅧ進行結構鑒定。

2 結 果

化合物Ⅰ:白色粉末，mp 54℃ ～55℃，溴酚藍反應顯黃色。ESI－MS m/z 284［M］+;m/z 256，185，129，97，83，73;EIMS顯示一系列遞減－CH2－的碎片峰，裂解符合脂肪酸裂解規(guī)律，分子式為 C18H36O2。1H－NMR(CDCl3，500 MHz)δ:0.87(3H，t，J=5.5 Hz，H－18)，1.25〔28H，m，(－CH2－)×16〕，1.63(2H，m，H－3)，2.34(2H，t，J=5.7 Hz，H－2)。參照文獻［4］鑒定其為十八烷酸，即硬脂酸(stearic acid)。

化合物Ⅱ:白色粉末，mp 62.0 ℃ ～ 62.5 ℃。ESI－MS m/z 257［M+H］+。1H－NMR(CDCl3，500 MHz)δ:2.34(2H，t，J=7.5 Hz，H－2)，1.64(2H，m，H－3)，1.26(24H，m，H－4 ～15)，0.88(3H，t，J=6.9 Hz，H－16)。參照文獻［5］鑒定其為十六烷酸，即棕櫚酸(palmitic acid)。

化合物Ⅲ:白色針晶，mp 79℃ ～80℃。ESI－MS m/z 406［M－H2O］+，297，157，139，111，97，83。1H－NMR(CDCl3，500 MHz)δ:0.88(6H，t，J=6.5 Hz，H－29)，1.25 ～ 1.50(52H，m)，3.58(1H，m)。參照文獻［6］鑒定其為二十九烷－10－醇，即白果醇(ginnol)。

化合物Ⅳ:無色針晶，mp 136℃ ～137℃，Liebermann－Burchard反應呈陽性。薄層層析行為與β－谷甾醇對照品一致，且與β－谷甾醇對照品混合熔點不下降。鑒定其為β－谷甾醇(β-sitosterol)。

化合物Ⅴ:白色粉末，mp 82℃ ～84℃。ESI－MS m/z 430［M－H2O］+，420，364，195，139，125，111，97。1H－NMR(CDCl3，500 MHz)δ:0.88(3H，t，J=6.5 Hz，H－32)，1.25 ～1.50(60H，m)，3.62(2H，t，J=6.5 Hz，H－1)。參照文獻［7］鑒定其為正三十二烷醇(n-dotriacontanol)。

化合物Ⅵ:無色片狀結晶。ESI－MS給出分子離子峰和典型的脂肪醇裂解碎片峰，m/z 308［M－H2O］+，280，252，168，111，97，83。1H－NMR(CDCl3，500 MHz)δ:0.88(3H，t，J=6.5 Hz，H－22)，1.25 ～1.45(40H，m)，3.61(2H，t，J=6.5 Hz，H－1)。參照文獻［8］鑒定其為正二十二烷醇(n-docosanol)。

化合物Ⅶ:白色針晶，mp 85℃ ～87℃，F(xiàn)eCl3反應呈紫色。ESI－MS m/z 348［M］+。1H－NMR(DMSO－d6，300 MHz)δ:10.53(2H，brs，－COOH，－OH)，7.16(1H，t，7.5 Hz，H－4)，6.72(1H，t，J=7.5 Hz，H－5)，6.65(1H，d，J=7.5 Hz，H－3)，2.71(2H，t，J=7.5 Hz，H－1')，1.59(2H，q，J=5.7 Hz，H－2')，1.25〔24H，br，(－CH2－)×12〕，0.86(3H，t，J=5.7 Hz， H－15')。13C－NMR(DMSO－d6， 75 MHz)δ:170.1(－COOH)，156.3(C－2)，141.5(C－6)，130.2(C－4)，120.0(C－5)，118.9(C－1)，113.5(C－3)，36.5(C－1')，31.0(C－13')，30.8(C－2')，28.8(C－4'～12')，28.6(C－3')，26.7(C－14')，13.6(C－15')。參照文獻［9－10］鑒定其為6－(十五烷基)－水楊酸，即氫化白果酸(hydroginkgolic acid)。

化合物Ⅷ:白色粉末，mp 40℃ ～42℃，F(xiàn)eCl3反應呈紫色。ESI－MS m/z 346［M］+。1H－NMR(CDCl3，300 MHz)δ:10.97(2H，brs，－COOH，－OH)，7.36(1H，t，7.5 Hz，H－4)，6.85(1H，t，J=7.5 Hz，H－5)，6.76(1H，d，J=7.5 Hz，H－3)，5.34(2H，m，H－8'，9')，2.98(2H，t，J=7.5 Hz，H－1')，2.01(4H，m，H－7'，10')，1.68(2H，t，J=7.2 Hz，H－2')，1.31〔16H，br，(－CH2－)×8〕，0.86(3H，t，J=5.7 Hz，H－15')。13C－NMR(CDCl3，75 MHz)δ:176.1(－COOH)，164.2(C－2)，146.7(C－6)，136.5(C－4)，130.5(C－8')，129.9(C－9')，123.5(C－5)，116.3(C－1)，110.5(C－3)，35.9(C－1')，32.0(C－H－7'，10')，30.4(C－13')，29.8(C－2')，29.6(C－6'，11')，29.3(C－4'，5'，12')，27.6(C－3')，22.2(C－14')，13.6(15')。參照文獻［9－11］鑒定其為 6－(8－十五碳烯)－水楊酸，即白果酸(ginkgolic acid)。

化合物Ⅸ:白色粉末，mp 78℃ ～80℃。ESI－MS m/z 415［M+H］+，398［M－H2O］+，370，342，98。1H－NMR(CDCl3，500 MHz)δ:4.20(1H，dd，J=11.6，4.6 Hz，H－1a)，4.15(1H，dd，J=11.5，6.5 Hz，H－1b)，3.94(1H，m，H－2)，3.70(1H，dd，J=11.5，4.0 Hz，H－3a)，3.61(1H，dd，J=11.5，5.5 Hz，H－3b)，2.35(2H，t，J=7.5 Hz，H－2')，1.62(2H，m，H－3')，1.29(36H，m)，0.88(3H，t，J=7.0 Hz，H－22')。參照文獻［12］鑒定其為二十二烷酸－1－甘油酯(monobehenin)。

化合物Ⅹ:白色粉末，mp 78℃ ～80℃。ESI－MS m/z 368［M－H2O］+，340，322，98。1H－NMR(CDCl3，500 MHz)δ:4.21(1H，dd，J=11.6，4.6 Hz，H－1a)，4.17(1H，dd，J=11.5，6.5 Hz，H－1b)，3.96(1H，m，H－2)，3.70(1H，dd，J=11.5，4.0 Hz，H－3a)，3.60(1H，dd，J=11.5，5.5 Hz，H－3b)，2.35(2H，t，J=7.5 Hz，H－2')，1.61(2H，m，H－3')，1.31(32H，m)，0.88(3H，t，J=7.0 Hz，H－20')。參照文獻［13］鑒定其為二十烷酸－1－甘油酯(glyceryl arachidate)。

化合物Ⅺ:白色無定形粉末，mp 72℃ ～74℃。ESI－MS m/z 331［M+H］+，313［M－H2O+H］+。1H－NMR(CDCl3，500 MHz)δ:4.21(1H，dd，J=11.6，4.6 Hz，H－1a)，4.16(1H，dd，J=11.6，6.1 Hz，H－1b)，3.95(1H，m，H－2)，3.69(1H，dd，J=11.6，4.0 Hz，H－3a)，3.60(1H，dd，J=11.6，5.8 Hz，H－3b)，2.35(2H，t，J=7.7 Hz，H－2')，1.62(2H，m，H－3')，1.29(24H，m)，0.88(3H，t，J=7.0 Hz，H－16')。參照文獻［14］鑒定其為十六烷酸－1－甘油酯(1－h(huán)exadecanoyl glyceride)。

化合物Ⅻ:白色無定形粉末。ESI－MS m/z 550［MH2O］+，特征性碎片離子354，331，313，299，239，171，98。1H－NMR(CDCl3，500 MHz)δ:4.16(5H，m，H－1，2，3)，2.35(4H，t，J=7.7 Hz，H－2'，2″)，1.62(4H，m，H－3'，3″)，1.29(48H，m)，0.88(3H，t，J=7.0 Hz，H－16'，16″)。參照文獻［15］鑒定其為1，3－二棕櫚酸甘油酯(1，3-dipalmitin)。

化合物ⅩⅢ:無色油狀物。ESI－MS m/z 616［M］+，特征性碎片離子 575，313，279，262，239，135，109，95。1H－NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.34(8H，m，H－9'，9″，10'，10″，12'，12″，13'，13″)，4.23(5H，m，H－1，2，3)，2.75(4H，dd，J=6.0 Hz，H－11'，11″)，2.29(4H，t，J=7.5 Hz，H－2'，2″)，2.03(8H，dt，J=6.5，7.5 Hz，H－8'，8″，14'，14″)，1.60(4H，m，H－3'，3″)，1.25 ～1.29(28H，m)，0.87(6H，t，J=7.5 Hz，H－18'，18″)。參照文獻［16］鑒定其為 1，3－二亞油酸甘油酯(1，3-dilinolein)。

化合物ⅩⅣ:白色無定形粉末，mp 74℃ ～75℃。ESI－MS m/z 890［M］+，特征性碎片離子 283，267，256，239，155，137，99，89，85，71。1H－NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.41(1H，m，H－2)，4.35(2H，dd，J=7.5，2.5 Hz，H－3)，4.30(2H，dd，J=7.5，2.5 Hz，H－1)，2.31(6H，m，H－2'，2″，2'″)，1.58(4H，m，H－3″，3'″)，1.51(2H，m，H－3')，1.25 ～ 1.29(78H，m)，0.88(9H，t，J=7.5 Hz，H－18'，18″，18'″)。參照文獻［17］鑒定其為甘油三硬脂酸酯(glycerol tristearate)。

化合物ⅩⅤ:白色無定形粉末，mp 60℃ ～62℃。ESI－MS m/z 806［M］+，特征性碎片離子 313，299，239，171，98。與甘油三棕櫚酸酯對照品的薄層層析Rf值及顯色行為一致。1H－NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.28(1H，m，H－2)，4.30(2H，dd，J=7.5，2.5 Hz，H－3)，4.16(2H，dd，J=7.5，2.5 Hz，H－1)，2.31(6H，m，H－2'，2″，2'″)，1.60(4H，m，H－3″，3'″)，1.52(2H，m，H－3')，1.25 ～1.29(66H，m)，0.88(9H，t，J=7.5 Hz，H－16'，16″，16'″)。參照文獻［18］鑒定其為甘油三棕櫚酸酯(glycerol tripalmitate)。

化合物ⅩⅥ:白色針晶，mp 300℃以上;易溶于丙酮和乙酸乙酯，難溶于水，硫酸不顯色，碘顯黃色(在空氣中放置漸變?yōu)榘咨?;與銀杏內酯B對照品薄層層析的Rf值及顯色行為一致;與銀杏內酯B對照品HPLC的保留時間均一致。鑒定其為銀杏內酯B(ginkgolide B)。

化合物ⅩⅦ:白色針晶，mp 300℃以上;易溶于丙酮和乙酸乙酯，難溶于水，硫酸不顯色，碘顯黃色(在空氣中放置漸變?yōu)榘咨?;與銀杏內酯A對照品薄層層析的Rf值及顯色行為一致;與銀杏內酯C對照品HPLC的保留時間均一致，鑒定其為銀杏內酯C(ginkgolide C)。

化合物ⅩⅧ:白色粉末，mp 272℃ ～274℃，硫酸－乙醇加熱顯紫紅色斑點，Liebermann－Burchard反應呈陽性，Molish反應呈陽性，與文獻［19］報道的結果一致;與胡蘿卜苷對照品薄層層析的Rf值及顯色行為一致;與胡蘿卜苷對照品混合熔點不下降。故鑒定其為胡蘿卜苷(daucosterol)。

從銀杏中種皮中共分離得到18個化合物，化合物Ⅴ、Ⅵ和Ⅸ～ⅩⅤ為首次從銀杏中獲得，所有化合物均為首次從銀杏中種皮中獲得。甘油酯類在制皂業(yè)中有重要作用，從銀杏中種皮中獲得7個甘油酯類成分，為銀杏中種皮的深度開發(fā)提供了一定空間。銀杏中種皮中還含有銀杏內酯，可通過優(yōu)化工藝富集此類成分，使銀杏中種皮資源得到充分開發(fā)利用。

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