鵝新城疫新型疫苗研究進展

徐鳳宇，李淑君，高云航，么乃全，胡靜濤，李茂輝

(1．吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，長春 130118;2．吉林農(nóng)業(yè)大學動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，長春 130118;3．吉林正大實業(yè)有限公司，長春 130033)

新城疫(Newcastle disease，ND)自1926年被發(fā)現(xiàn)以來，檢測到的易感動物種類不斷增多，除雞、鴿、孔雀、鵝等250多種鳥類外，也包括豬。該病病原新城疫病毒(NDV)隸屬副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬，依血清學反應(yīng)和系統(tǒng)進化分析結(jié)果，本屬中禽源病毒被劃分為10個血清型，即禽副黏病毒1～10(APMV－1～APMV－10)，NDV被確定為APMV － 1［1］。

自1990年以來，新城疫給養(yǎng)鵝業(yè)造成了嚴重經(jīng)濟損失。據(jù)報道，2005－2008年分離自我國東部的禽(包括雞、野鴿、鵝和鴕鳥)源NDV以基因Ⅶd亞型為主(57/79)［2］，這也是當前流行的鵝新城疫病毒(GPMV)的優(yōu)勢基因型，該型與La Sota株核苷酸同源性不高，有些僅為 84．3% 或 82．6%［3］;本室分離的MHK－1株的HN、F基因與La Sota株的相應(yīng)基因核苷酸同源性分別為83%和85%;Li等［4］的研究表明，GPMV NA－1株與雞新城疫強毒標準株F48E9有相同的抗原成分，但確實存在抗原差異;交叉攻毒保護試驗結(jié)果表明，對制苗毒株的保護率高于非制苗毒株，即在用NA－1株攻毒時，F(xiàn)48E9株和NA－1株疫苗免疫的雞保護率分別為60%、90%，鵝的保護率分別為70%、100%，提示傳統(tǒng)新城疫疫苗對鵝新城疫預(yù)防效果不甚理想，所以該病仍時有發(fā)生。為了更好地防制本病，減少排毒和傳播，研制理想疫苗或改善生產(chǎn)工藝是國內(nèi)外努力的目標之一［5］。本文結(jié)合NDV的保護性抗原，就近些年鵝新城疫新型疫苗的研究現(xiàn)狀作以綜述，以期為該病的疫苗研制提供參考。

1 新城疫病毒的主要保護性抗原

NDV基因組結(jié)構(gòu)模式為3’－NP－P－M－FHN－L－5’，分別編碼核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素－神經(jīng)氨酸酶(HN)和大聚合蛋白(L)6個主要多肽［6］，其中F和HN蛋白是NDV表面的主要保護性抗原，也是主要的毒力因子。

在F蛋白上第116、117位氨基酸之間有酶切位點，可被細胞蛋白酶水解，產(chǎn)生F1和F2兩部分，大多數(shù)致病毒株在裂解位點前后有112R/K－RQ/K/R－K/R－R－F117序列，而弱毒株或無毒株此位點的氨基酸序列為112G/E－K/R－Q－G/ER －L117［7］。據(jù)報道［8］，1997 ～ 2001 年分離的大部分(10/11)毒株的F基因高度同源，但與許多NDV參考株及分離株相比，第 52、71、176、272、314、402、489位出現(xiàn)了特征性氨基酸變化，與同期或稍早期的雞源NDV有較高同源性。NDV基因組全長有三種形式，其中長度為15 186 bp和15 192 bp的屬于Class II，長度為 15 198 的屬于 Class I［9－10］，報道的Class I毒株(如DE－R49/99)較少見，當前應(yīng)用的疫苗株(La Sota等)和歷史上的流行株(IT/3286/00等)多屬于Class II。根據(jù)病毒F基因序列，Class II中的NDV曾被分為I－Ⅸ、XI 10個基因型;最近Diel等［11］又將602株 ClassⅡ NDV構(gòu)建種系發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)還包括5個新的基因型，即X、Ⅻ、XⅢ、XⅣ和XV，足見NDV處于不斷變異中。

HN蛋白可結(jié)合唾液酸受體、活化F蛋白、促進病毒釋放，所以在病毒入侵、成熟過程中扮演重要角色，直接影響病毒的毒力。Yuan等［12］發(fā)現(xiàn)無毒Ulster株HN蛋白C末端延伸區(qū)導致了功能的自體抑制，可能與其毒力弱相關(guān)。與經(jīng)典的雞源NDV相比，未發(fā)現(xiàn)1997－2001年分離的鵝源NDV HN蛋白細胞受體結(jié)合相關(guān)區(qū)域的氨基酸序列有明顯不同，而在第 48、54、77、266、340、380 位出現(xiàn)了6 個特征性氨基酸突變［8］。另外，該蛋白存在5個最強的線性表位，即 193～201位、345～353位、513 ～521位、494 位及569位氨基酸區(qū)域［13］。

2 鵝新城疫新型疫苗

鑒于鵝新城疫對養(yǎng)鵝業(yè)的危害及變異株的出現(xiàn)，為了防控該病，在應(yīng)用基因Ⅶ型滅活苗預(yù)防該病的同時，很多研究者開展了新型疫苗的相關(guān)研究，DNA疫苗、基因工程亞單位疫苗、活載體疫苗均有報道，尤其是應(yīng)用反向遺傳技術(shù)制備的減毒活疫苗具有很大的應(yīng)用潛力。

2．1 DNA疫苗 DNA疫苗可在動物機體內(nèi)持續(xù)表達抗原，誘發(fā)體液免疫和細胞免疫，是當前研究的主要新型疫苗之一。劉舉芳等［14］用含NA－1株的F蛋白及致弱F蛋白的真核表達質(zhì)粒pCI－F、pCI－rF及La Sota疫苗分別免疫雛雞，結(jié)果pCI－F、pCI－rF的保護力無顯著差異，且二者都不及La Sota疫苗，可見單基因的DNA疫苗不宜用于鵝新城疫的免疫。

2．2 基因工程亞單位疫苗 桿狀病毒表達系統(tǒng)具有高水平表達外源基因的特性。楊雪晶等［15］應(yīng)用Bac to Bac系統(tǒng)在Sf9昆蟲細胞中表達了GPMV的HN蛋白。畢玉海等［16］將GPMV NA－1株的F基因和鵝細小病毒(GPV)GD－01株的VP3基因用Bac to Bac系統(tǒng)進行表達，得到了重組蛋白F－VP3，免疫雛鵝后可誘導鵝產(chǎn)生抗GPMV HI抗體和抗GPV中和抗體。

畢赤酵母表達系統(tǒng)可使外源蛋白更具天然生物學活性，馮新等［17］將 GPMV NA －1株的 F、HN基因分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)畢赤酵母中，獲得酵母表達的F和HN蛋白，均可與GPMV多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。

但到本文截稿為止，未見有應(yīng)用基因工程亞單位疫苗進行免疫保護試驗的相關(guān)報道，是否可應(yīng)用于臨床預(yù)防鵝新城疫尚需進一步研究。

2．3 重組活載體疫苗 痘病毒載體可容納較多的外源基因。楊玉菊等［18］構(gòu)建了GPMV的HN和F基因的重組禽痘病毒，二者在雞胚成纖維(CEF)細胞中獲得表達并表現(xiàn)出良好的反應(yīng)原性。于志丹等［19］將GPMV的F基因與GPV的VP3基因連接，轉(zhuǎn)染禽痘病毒感染的CEF細胞，獲得了有效表達，且兩種蛋白都保持反應(yīng)原性。

減毒沙門菌作為載體可激發(fā)強烈的體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫。潘志明等［20］構(gòu)建了含GPMV JS5株F基因的重組沙門菌SL7207(pVAX1－F)，表明其對雛雞的免疫保護率為77．27%，明顯高于空載體對照組。以上試驗為進一步研制活載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。

2．4 減毒活疫苗 反向遺傳技術(shù)可快速、定向致弱毒株，在控制ND的發(fā)生和流行方面有較大優(yōu)勢和潛力，與強毒株相比，致弱毒株能有效降低攻毒后試驗動物的排毒量。Hu等［21］將F蛋白裂解位點的112、115和117位堿性氨基酸突變成弱毒株特征的非堿性氨基酸，即由112R－R－Q－K－R－F117變?yōu)?12G－R－Q－E－R－L117，應(yīng)用反向遺傳技術(shù)拯救出了弱毒株NDV/ZJ1FM;由于該毒株的 EID50較低，又將HN基因替換成JS5/05株(HA=9log2)的HN，拯救出的病毒被命名為NDV/ZJ1HN，體外試驗表明NDV/ZJ1HN株的最小致死劑量雞胚平均死亡時間(MDT)超過120 h，對1日齡雛雞的腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)為 0．16，EID50為 109．1/mL，血凝價為9log2;后續(xù)免疫保護試驗表明，NDV/ZJ1HN株活苗或滅活苗能有效保護致死量的JS5/06株GPMV的攻擊，與La Sota株免疫雞、鵝相比減少了排毒量。Hu等［22］以基因Ⅶ型JS5/05毒株為研究對象，通過反向遺傳操作改變了F蛋白裂解位點的氨基酸序列，制備出了無毒的NDV/AI4株病毒，用雞胚連續(xù)培養(yǎng)10代表明復(fù)制有效且遺傳穩(wěn)定，其油乳膠苗誘導的雞和鵝的HI抗體產(chǎn)生較快且效價均高于La Sota苗，用JS3/05攻毒的保護試驗表明能提供有效保護，且免疫動物的排毒量明顯低于La Sota苗。孫玉章也應(yīng)用反向遺傳技術(shù)及NA－1株GPMV構(gòu)建了人工致弱的病毒株rNA－1－F’，測得的MDT為96 h［23］。以上研究為 GPMV弱毒疫苗的生產(chǎn)及商品化奠定了基礎(chǔ)。

3 展望

目前常規(guī)疫苗仍是預(yù)防鵝新城疫的首選，新型疫苗研究方興未艾，很多新技術(shù)也應(yīng)用于此，但仍處于研究階段。新的措施也可嘗試:一是多表位、多蛋白疫苗或加有分子佐劑或密碼子優(yōu)化的疫苗。程寶艷等克隆了NDV F基因的3段抗原表位，拼接成多表位串聯(lián)基因，表達的蛋白抗原性良好，用其制備了鼠源抗 NDV F 蛋白抗體［24］;曾偉偉［25］將NDV的F基因密碼子優(yōu)化為雞體內(nèi)偏嗜的密碼子，分別構(gòu)建了重組質(zhì)粒pVAX1－optiF和pVAX1－F，前者對雞的免疫保護率(12/12)顯著高于后者(2/12);用IL－2和不同拷貝數(shù)的C3d作為分子佐劑構(gòu)建的質(zhì)粒誘導的保護性體液免疫、細胞免疫以及對強毒攻擊的保護效果均好于相應(yīng)的其他質(zhì)粒。Loke等［26］將構(gòu)建的基因疫苗 pEGFP－HN和pEGFP－F分別皮下注射免疫SPF雛雞，對強毒的保護率分別為33．3%和50．0%;而用pEGFP－HN和pEGFP－F共同免疫保護率達90%。二是考慮轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗或以其他材料為載體的疫苗。轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗的植物載體易于保存，使用方便，市場潛力大，發(fā)展前景十分廣闊。楊振泉等曾以NDV的F為外源基因，用水稻作為表達系統(tǒng)，將NDV－F基因穩(wěn)定整合到水稻基因組中并表達，免疫小鼠后可誘導產(chǎn)生一定水平的NDV－F蛋白特異抗體［27］，但轉(zhuǎn)基因疫苗的安全性需要有足夠的證據(jù)支持;Palya等以火雞皰疹病毒為載體構(gòu)建了NDV的F基因重組疫苗，卵內(nèi)和皮下接種Broiler雞，也收到了較好的免疫效果［28］。

除APMV－1外，APMVs 2－4、6－9也被從家禽或野鳥中分離到，偶爾會引起呼吸和繁殖疾病。Laura等［29］從2000－2005年9128份岸禽和鷗的泄殖腔拭子中分離到60株禽副黏病毒，其中41株為APMV－1，19株為APMV－2，推測新城疫病毒繼續(xù)變異也完全可能。另外，即使是基因Ⅶ型NDV，也不僅感染鵝，還感染雞，對鴿也具有較強的致病性［30］。所以，研制有效、減少排毒的疫苗對養(yǎng)禽業(yè)十分重要。根據(jù)OIE的規(guī)定［1］，為保證疫苗的安全性，NDV弱毒苗種毒的ICPI值要不高于0．4，值得研究者借鑒。

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