豬流行性腹瀉病毒檢測方法研究進展

莊金秋，梅建國，王金良，沈志強* ，丁 壯

(1．山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，中國山東濱州 256600;2．吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，中國吉林長春 130062)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由冠狀病毒科冠狀病毒屬的豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種豬的高度接觸性腸道傳染病，以水樣腹瀉、嘔吐、脫水和食欲下降為主要特征。本病有一定的季節(jié)性，多發(fā)生于冬季12月至次年2月寒冬季節(jié)，但在夏季也可發(fā)生。PED在各年齡的豬均可感染，傳播迅速，年齡越小，發(fā)病率和病死率越高，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失。PEDV于1977年由比利時的Pensaert首先發(fā)現(xiàn)，并從病料中分離出一株不同于豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)的病毒，將其命名為類冠狀病毒(CVL)CV777株。隨后英國、匈牙利、西德、加拿大、日本等國相繼報道有該病的發(fā)生。1982年國際病毒分類委員會將該病毒歸類為冠狀病毒屬。我國于1980年首次分離到PEDV。近年來，PED的流行區(qū)域有不斷擴大的趨勢，成為嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病之一［1－3］。PEDV與TGEV同屬冠狀病毒屬成員，二者在病毒粒子形態(tài)、臨床癥狀及流行病學(xué)方面極為相似，難以區(qū)分。對于PED的確診，有賴于實驗室檢測。本文就PEDV的實驗室檢測方法研究進展作一綜述，以為PED的確診提供參考。

1 病毒分離鑒定

1．1 病毒的細胞培養(yǎng) 與其他冠狀病毒相比，PEDV的細胞培養(yǎng)相對比較困難，從PEDV發(fā)現(xiàn)開始，很多研究人員嘗試用不同的方法將PEDV適應(yīng)于細胞，但用了近10年的時間都沒有取得成功，這在一定程度上制約了PEDV研究進程。直到1988年，Hofmann M等［4］首次在培養(yǎng)基含胰酶的 Vero細胞上成功繁殖出PEDV，并認為胰酶對PEDV纖突糖蛋白切割作用增強了病毒對Vero細胞的感染力，此方法在PEDV分離、細胞培養(yǎng)和疫苗的研究中被廣泛應(yīng)用;此后，Kusanagi K 等［5］(1992)對PEDV細胞培養(yǎng)進行了深入研究，相繼在仔豬膀胱、腎臟的原代細胞和 KSEK6、IBRS2、MA104、CPK、ESK的傳代細胞系上成功培養(yǎng)了PEDV。我國李樹根等［6］(1993)已有PEDV在Vero細胞上培養(yǎng)成功的報道。李品齊等［7］(1997)用含有60μg/mL胰酶液的Vero細胞培養(yǎng)液中進行PEDV傳代適應(yīng)，在第3代就出現(xiàn)明顯的 CPE，第5代毒價可達10－7．0/0．1mL，并通過乳豬回歸試驗和特異性中和試驗證實所增殖的病毒為豬流行性腹瀉病毒。修金生等［8］(2012)所在研究室參考國內(nèi)外文獻，將胰酶濃度控制在6μg/mL連續(xù)傳5代而獲得病毒。

PEDV的體外細胞培養(yǎng)難度大，繁殖條件復(fù)雜，病毒在細胞培養(yǎng)中繁殖滴度低，細胞病變產(chǎn)生不明顯，一直是PEDV體外增殖過程的一個重要技術(shù)瓶頸，直接影響了對該病毒生物學(xué)特性基礎(chǔ)研究和實踐中該病毒相關(guān)生物制品的發(fā)展。PEDV在細胞上的成功培養(yǎng)對其研究具有重要意義，解決了PEDV研究的瓶頸問題，為PEDV理化特性、疫苗及其相關(guān)分子生物學(xué)的研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，使PEDV的研究進入了一個新階段。

1．2 免疫電鏡法(IEM) 一般來說，電鏡法可以有效的作出病原的診斷，可以通過電鏡來觀察病毒的結(jié)構(gòu)、形態(tài)特征及立體構(gòu)型等特點。如將感染豬小腸或病毒細胞培養(yǎng)物制成超薄切片在電鏡下觀察，則可從平面上觀察到病毒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，形態(tài)大小，復(fù)制方式等。由于PEDV與TGEV同屬冠狀病毒，形狀非常相似，在普通電鏡下無法區(qū)別，為此需用免疫電鏡法(IEM)。IEM法既可用已知的PEDV高免血清檢測未知抗原，又可用已知的PEDV抗原檢測未知抗體。如可疑病料中含有PEDV病毒粒子，由于抗原和抗體的特異性結(jié)合，病毒粒子呈晶格狀排列，并可見到毒粒間的抗體橋。王繼科等［9］(1991)把PEDV的抗原和抗體分別經(jīng)10000 r/min離心、免疫復(fù)合物又經(jīng)12000 r/min離心后，通過電鏡觀察到了典型的病毒粒子形成的免疫復(fù)合物，并建立了具有3次篩選作用改良的IEM法。該方法簡便、直觀、快速、定性準確，但該方法要求有價格高昂的電鏡設(shè)備，而且電鏡檢查一般需3～7 d才能出報告，不適用于大規(guī)模臨床診斷。

2 血清學(xué)檢測

2．1 微量血清中和試驗(NT) 林志雄等［10］(1994)利用已適應(yīng)于傳代細胞生長的PEDV－G1株，以PK－15作指示細胞，與被檢血清進行微量中和，測定待檢血清中的特異性抗體，48h進行結(jié)果判定，證實該方法可以用來檢測PEDV，而且檢測結(jié)果準確、可靠，具有較高的敏感性，可用于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。但該方法需要標(biāo)準毒株作為指示毒株和成熟的細胞培養(yǎng)體系，實驗條件的限制因素比較多，很難在短期內(nèi)應(yīng)用于臨床實踐。

2．2 免疫熒光法(IF) 免疫熒光(IF)一般分為直接免疫熒光(FAT)、間接免疫熒光(IFAT)和免疫過氧化物酶技術(shù)，3種方法都可應(yīng)用于實驗室診斷。若IF或免疫過氧化物酶試驗呈陽性，并伴有腹瀉癥狀，則幾乎肯定為PEDV。試驗研究證明，F(xiàn)AT檢測病料中的PEDV抗原是一種比較可靠的特異性診斷方法，目前應(yīng)用最為廣泛。本方法適用于急性期內(nèi)(5～7 d)患豬小腸黏膜的檢查及對病毒分離物鑒定。取病豬小腸作冰凍切片或小腸黏膜抹片，風(fēng)干后丙酮固定，加熒光抗體染色，充分水洗，封蓋鏡檢，1～2 h即可得出結(jié)果。為了與TGEV鑒別，最好同時用TGEV熒光抗體染色檢查。崔現(xiàn)蘭等［11］(1990)應(yīng)用FAT檢查病豬小腸的冷凍切片或小腸抹片，對PEDV人工感染仔豬檢出率為91．4%。朱維正等［12］(1990)用間接血凝試驗與IFAT比較后認為IFAT法更敏感。林志雄等［13］(1997)用適應(yīng)于 Vero、PK15等傳代細胞株生長繁殖的PEDV－G1株建立了FAT法。同時，與哈爾濱獸研所的熒光抗體方法比較，陽性符合率達95%(19/20)，陰性符合率90%(9/10)。并不與TGEV、豬細小病毒(PPV)、輪狀病毒和大腸桿菌等發(fā)生交叉反應(yīng)。證明該方法具有較高的準確性和特異性。由于免疫熒光技術(shù)需要在病死豬只或在腹瀉早期撲殺后取腸道組織制備切片，故很難用于臨床診斷。

2．3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA法) 用ELISA方法檢測PEDV被大量應(yīng)用于臨床實踐中，該法既可用于測定抗原，也可用于測定抗體，是國際貿(mào)易指定標(biāo)準診斷方法之一。ELISA最大的優(yōu)點是可從糞便中直接檢查PEDV抗原，而且比電鏡更敏感、可靠，目前應(yīng)用較為廣泛。當(dāng)病豬一出現(xiàn)腹瀉，即可進行檢測，甚至痊愈不久的病豬，仍可用該方法進行檢測。在國外，Oh JS等［14］(2005)建立了間接ELISA診斷方法，與病毒血清中和試驗對比證明，該ELISA方法具有較高的敏感性和特異性，能用于PEDV的檢測。Rodak L等［15］(2005)建立了競爭阻斷ELISA診斷方法，適于PEDV流行病學(xué)調(diào)查。Hou XL等［16］(2007)建立了檢測 PEDV血清的ELISA方法，為PEDV血清學(xué)監(jiān)測提供手段。國內(nèi)于強等［17］(1987)建立了間接ELISA法檢測PED抗體的方法。朱維正［18］(1988)建立了雙抗體ELISA法，從腹瀉病豬糞便中直接檢測病毒抗原。陳茹等［19］(1997)建立了用于檢測 PEDV抗體的Dot－ELISA，并對比了該方法和瓊脂擴散試驗的檢測情況，結(jié)果表明，Dot－ELISA更敏感，且該法重復(fù)性較好。鄒勇等［20］(2000)用PEDV細胞培養(yǎng)物提純的抗原，組織毒免疫獲得的高免血清建立了間接ELISA檢測PEDV抗體水平。田間檢測結(jié)果與臨床發(fā)病和預(yù)期結(jié)果一致。

2．4 免疫組化法 韓國學(xué)者Kim O等［21］(1999)建立了可在福爾馬林固定、石蠟包埋的腸組織中準確而特異的檢出PEDV的單克隆抗體基礎(chǔ)上的免疫組化法，該方法也可用于鑒別診斷 PEDV與TGEV。但該方法對病料的前期處理比較繁瑣。

2．5 膠體金免疫層析法(GICA) 張利勃等［22］(2011)為建立了一種高效、經(jīng)濟、簡便適用于基層防疫檢疫人員使用的PED疾病的GICA檢測方法，由此制成一種檢測PEDV血清抗體的快速診斷試紙。該GICA與ELISA具有相近的靈敏度，在二者檢測的75份臨床樣本中有65份共同檢測為陽性結(jié)果，7份共同檢測為陰性結(jié)果，其符合率達96%。說明該GICA檢測技術(shù)的建立為檢測PEDV抗體提供了一種快速簡便的方法。

3．3 分子生物學(xué)檢測

3．3．1 原位雜交技術(shù)(ISH) 原位雜交技術(shù)(in sit hybridization，ISH)是分子生物學(xué)、組織化學(xué)及細胞學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新興技術(shù)，始于20世紀60年代。原位雜交技術(shù)的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細胞或染色體上待測DNA或RNA互補配對，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。為顯示特定的核酸序列必須具備3個重要條件:組織、細胞或染色體的固定、具有能與特定片段互補的核苷酸序列(即探針)、有與探針結(jié)合的標(biāo)記物。Kim O等［23］(2002)利用標(biāo)記地高辛的核酸探針(0．1 ng/μL)加入的300μL的標(biāo)準雜交緩沖液中，在加熱板上95℃加熱10 min后把組織切片放到冰上淬火。大約有50 ng的地高辛的核酸探針添插到標(biāo)準雜交緩沖液中(50μL)。通過一系列的處理后，標(biāo)記地高辛的核酸探針可以與人工感染仔豬的PEDV的核衣殼蛋白基因進行堿基互補配對，通過透射電鏡下觀察到仔豬的空腸和結(jié)腸的上皮細胞的胞質(zhì)呈黑色。從而可以證明是PEDV感染的仔豬腹瀉。該試驗在79個陽性樣本中檢測出71個是陽性的，檢出率為91%。另外，該試驗還證明，原位雜交技術(shù)對于檢測福爾馬林溶液固定的組織樣本較為敏感，其檢測效果較好。

3．3．2 PCR技術(shù) 近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對于PEDV和TGEV核酸的檢測方法越來越受到人們的重視。有研究表明，RT－PCR法是目前鑒別診斷TGEV和PEDV最敏感、特異的方法。與傳統(tǒng)方法比較，RT－PCR方法只需要病豬的糞便即可進行活體診斷，便于疾病的早期診斷，敏感性和特異性高，而且操作步驟更加快速、方便，一般4～6 h內(nèi)可以提供準確的結(jié)果。Ishikawa等［24］(1997)根據(jù)S基因序列設(shè)計了一對可擴增目的片段854 bp的引物，成功的建立了檢測PEDV的RT－PCR法，可進行細胞毒和糞便毒的檢測。Kubota等［25］(1999)以M基因和N基因為靶基因也成功建立了可進行PEDV細胞毒和糞便毒的RTPCR檢測方法。Kim O等［23］(2002)建立了 TGEV和PEDV的二聯(lián)RT－PCR診斷方法，可同時檢測出10TCID50/mL的TGEV和PEDV。并對免疫組化、原位雜交、RT－PCR三種方法進行了比較，認為RT－PCR法檢測結(jié)果的重復(fù)性最好。但當(dāng)被檢樣品為福爾馬林固定時，采用免疫組化和原位雜交這兩種方法更適合。此外，Kim O等還建立了鑒別TGEV和PEDV的多重巢式RT－PCR法。此方法適用于檢測福爾馬林固定的組織。Song等［26］(2006)建立了鑒別診斷PEDV、TGEV和豬輪狀病毒(PORV)的多重RT－PCR(Multi－RT－PCR)，為鑒別3種病毒性腹瀉病原的混合感染提供了技術(shù)支持，同時又建立了檢測PEDV的實時熒光定量PCR，對仔豬體內(nèi)PEDV的病毒載量進行了定量。國內(nèi)，吳凌等［27］(2003)建立了用于檢測PEDV的巢式RT－PCR方法。張素芳等［28］(2004)建立了嵌套式RT－PCR方法，不僅可以檢測細胞培養(yǎng)中的PEDV，亦可以檢測糞樣中的PEDV，靈敏性和特異性較好。賈赟等［29］(2005)在優(yōu)化RT－PCR反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，建立了檢測PEDV的新型套式RT－PCR方法，并用該方法對PEDV進行了快速診斷和分析。陳芳等［30］(2005)、楊群等［31］(2006)、鄧等［32］(2009)、趙雯雯等［33］(2010)為了檢測、區(qū)分TGEV和PEDV，建立了同時檢測這兩種病毒的多重RT－PCR方法。用于臨床TGEV和PEDV引起的豬腸道疾病的鑒別診斷。張坤等［34］(2010)建立了一種新的能夠同時檢測PEDV、TGEV和GAR的多重RT－PCR方法，并將這種方法和常規(guī)的RT－PCR進行了比較。多重RT－PCR檢測方法能夠檢測到35 pg的TGEV－PEDV－GAR三聯(lián)苗的混合RNA。該方法敏感性高、特異性強，是一種新的檢測PEDV、TGEV和GAR的方法。隨著人們對PCR技術(shù)的不斷完善和創(chuàng)新，越來越多敏感、特異的PCR方法被應(yīng)用于PEDV的檢測。

3．3．3 熒光定量PCR技術(shù) 熒光定量PCR(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q －PCR)技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準曲線對未知模板進行定量分析的方法。PCR定量技術(shù)克服了傳統(tǒng)PCR易污染、后處理步驟繁雜冗長、缺乏準確定量等缺點，具有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點，在PEDV診斷方面也取得了進展。Kim SH等［35］(2007)根據(jù)Taq Man探針熒光定量分析原理建立了多重實時熒光定量PCR，為PEDV和TGEV病毒載量的檢測提供了技術(shù)手段。劉鄧等［36］(2010)建立了Taq Man熒光定量PCR方法。以質(zhì)粒作為模板時，在40個循環(huán)內(nèi)即可檢測到10copies/μL的質(zhì)粒DNA。比Kim O等建立的常規(guī)的RT－PCR方法敏感性至少提高了l0倍。并對TaqMan熒光定量RT－PCR法和RT－PCR法的檢測結(jié)果進行了對比和分析，結(jié)果表明普通RT－PCR檢測PEDV存在漏檢的可能，而TaqMan熒光定量RT－PCR法具有準確、定量、污染低、靈敏度高、特異性強及省時省力等優(yōu)點。王金良等［37］(2010)、修金生等［38］(2012)建立了檢測 PEDV的 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法，為該病的早期診斷并定量分析PEDV感染程度奠定了基礎(chǔ)。該方法操作簡便、重復(fù)性好，敏感性高，可實時定量分析病毒核酸在動物體內(nèi)的含量，從而明確PEDV感染程度，并能為PEDV的早期診斷提供重要參考。

4 存在的問題與展望

綜上所述，在PEDV的檢測中，近年來研究的側(cè)重點主要是ELISA法和PCR法，這兩種方法以其實用性強、高效、快速、準確而被廣泛應(yīng)用。尤其是PCR檢測技術(shù)，比ELISA法更加敏感，特異性也較強。盡管PCR法的敏感性和特異性都很好，但由于對儀器設(shè)備等要求很高，特別是熒光定量PCR方法對實驗操作人員以及實驗條件等的要求較為嚴格，以及檢測成本的限制，因此在推廣上仍有很大的限制。近年來建立起來的PEDV膠體金抗體檢測試紙條方便、快速、安全，便于操作，是一種環(huán)保型的檢測方法，但只能用于抗體水平的檢測。在實際工作中，可根據(jù)實驗室基礎(chǔ)條件綜合選用合適的檢測方法。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和人們對PEDV研究的不斷深入，更多更為高效、敏感、特異、快速、簡易而且價廉的檢測方法將會被研究建立起來。

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