細菌非編碼小RNA的分類及功能簡介

聶佳佳，金 鑫，孟憲臣，朱國強

（揚州大學獸醫(yī)學院，揚州 225009）

長期以來，RNA一直被人們誤解，認為僅是DNA和蛋白質(zhì)之間的“中介”，是遺傳信息的“過渡”，它從DNA獲得遺傳信息再把它轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)，從而確保了遺傳信息的穩(wěn)定。直到1967年，通過對大腸桿菌體內(nèi)所有的RNA進行標記，在聚丙烯酰胺凝膠上探測到一種數(shù)量較多的新RNA分子，并將其命名為sRNA-6S RNA[1]，人們才窺探到sRNA世界的冰山一角。近年來，隨著生物信息學、cDNA文庫及分子克隆等技術的發(fā)展，在原核生物體內(nèi)越來越多的小分子RNA被發(fā)現(xiàn)，我們才真正領略到了小分子RNA的無限魅力。

細菌非編碼小 RNA (Non-coding，small RNA，簡稱sRNA）是一類長度為40～500個核苷酸，在基因組中被轉(zhuǎn)錄但是不編碼蛋白質(zhì)的一類RNA分子[2]，轉(zhuǎn)錄通常開始于一段能折疊成穩(wěn)定莖環(huán)結構的序列，終止于一個Rho不依賴的轉(zhuǎn)錄終止子，莖環(huán)結構有助于穩(wěn)定整個分子, 因此大多數(shù)sRNA明顯比mRNA穩(wěn)定。sRNA在感應外界環(huán)境變化，控制基因表達中發(fā)揮十分重要的作用。大多數(shù)sRNA位于2個蛋白編碼基因之間的非編碼區(qū)，即閱讀框（open reading frame，ORF）之間。還有一些 sRNA 是從mRNA的5'或3'非轉(zhuǎn)譯區(qū)域剪切下來的。sRNA廣泛存在于各種細菌染色體上，少部分存在于質(zhì)粒、噬菌體或轉(zhuǎn)座子上[3]。

1 sRNA的作用機制以及分類

現(xiàn)已證明幾乎所有的生物體均含有sRNA分子。但細菌中sRNA分子的生物學功能大多尚未闡明。就目前已鑒定的sRNA，根據(jù)其生物學功能以及作用機制可分為3大類:

1.1 具有特殊活性的sRNA行使持家功能的sRNAs，它們高度表達并且是必需的。目前發(fā)現(xiàn)此類細菌sRNA有三種，包括具有酶催化活性并形成RNase P的催化亞單位M1RNA、轉(zhuǎn)移信使RNA（transfer messenger RNA，tmRNA 或 10SaRNA）[4]以及組成核糖核蛋白（ribonueleoprotein，RNP）復合物 4.5S RNA。

1.1.1 M1 RNA M1 RNA 是一種具有特殊功能的sRNA，是RNase P（一種關鍵的RNA加工酶，對細胞存活是必需的)的催化亞單位，長377個核苷酸，由初始轉(zhuǎn)錄物經(jīng)RNase E在3'端加工而成。RNase P具有內(nèi)切酶活性，能夠?qū)RNA前體的5'端進行剪切形成成熟的tRNA。

1.1.2 tmRNA tmRNA 同時具有 tRNA 和 mRNA 的性質(zhì)，又稱10saRNA，長363 nt，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一、且在所有細菌中均存在的sRNA。它在體外可以被丙氨酰tRNA合成酶氨?；?，說明tmRNA具有類似tRNA結構。但tmRNA沒有反密碼子的莖環(huán)結構，比tRNA大得多。同時，tmRNA分子含有一個開放閱讀框，可以編碼長度為8～35個氨基酸殘基的羧基端標記序列，說明它還具有mRNA的特性。正因為如此，在反式轉(zhuǎn)譯反應中，tmRNA分子在小分子蛋白SmpB的參與下，起到tRNA和mRNA的雙重功能作用，丙氨酰-tmRNA識別由于mRNA 缺乏終止密碼子而停滯在mRNA 3'端停滯的核糖體，并進入A位；新生肽轉(zhuǎn)移至tmRNA的丙氨?；?，核糖體則轉(zhuǎn)位至tmRNA編碼的標記序列的閱讀框結構上，生成由缺少終止密碼子的mRNA編碼的多肽，該多肽羧基末端加上了標記序列。而帶有該標記序列的多肽則成為了蛋白質(zhì)水解酶的目標。停滯的核糖體在標記序列ORF的終止密碼處脫落，能夠進入到新蛋白質(zhì)合成中去，從而減少由于停滯的核糖體和不完整的蛋白質(zhì)對細胞產(chǎn)生的損傷[5]。

1.1.3 4.5S RNA 4.5S RNA 在蛋白質(zhì)分泌過程中作為信號識別顆粒（SRP）的一個必需組分起作用。長114 nt，由前體分子經(jīng) RNase P 5'端加工而來。在細胞中，編碼4.5S RNA的基因是必需的，常與核糖體相結合而在轉(zhuǎn)譯過程中起作用，與SRP及其受體（FtsY蛋白）一起介導蛋白質(zhì)靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細菌質(zhì)膜的運輸。缺乏該基因會抑制蛋白質(zhì)合成[6]。

1.2 與蛋白質(zhì)相互作用而影響蛋白質(zhì)功能的sRNA這類sRNA主要通過與蛋白質(zhì)相互作用從而影響這些蛋白質(zhì)的生物學功能，本文著重介紹以下兩個sRNA:6S RNA是除了rRNA和tRNA外大腸桿菌中已測定序列的第一個RNA分子[7]，為一個雙順反子mRNA的一部分轉(zhuǎn)錄而來的。長度為184 nt，在原核生物中高度保守并且在穩(wěn)定期逐漸積聚, 它能夠與σ70- RNA聚合酶相互作用并改變它對啟動子識別的特異性[8]。PspF 基因是高pH條件下細菌生存所必需的，序列分析顯示其-10 bp上游含有TGn序列，是6S RNA作用的靶 mRNA[9-11]。6S RNA能夠與s70-RNA聚合酶全酶結合改變RNA聚合酶的活性，從而抑制啟動子區(qū)域-10 bp上游含TGn序列（TGnTATAAT）基因的轉(zhuǎn)錄。6S RNA可能的作用是穩(wěn)態(tài)期均衡營養(yǎng)的需求，降低應激條件的應答以儲存能量[7,12]。

CsrB RNA和CsrC RNA能夠與全局轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子CsrA蛋白相互作用形成一個調(diào)控反應回路。在這個回路中，這2個RNA分子作為CsrA蛋白的拮抗物，嚴緊地調(diào)控著該蛋白的活性。CsrA是由61個氨基酸殘基組成的小分子轉(zhuǎn)譯調(diào)控蛋白，通過與glgC (糖原代謝)基因轉(zhuǎn)錄物的核糖體結合位點周圍的序列結合抑制轉(zhuǎn)譯的起始。大腸桿菌中sRNA分子CsrB全長369 nt，有22個與CsrA結合位點一致的序列，可通過與CsrA結合抑制CsrA的功能。CsrC也通過相同的方式作為CsrA蛋白的拮抗物發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[13]。

1.3 與目的mRNA配對結合調(diào)控基因表達的sRNA這是細菌sRNA發(fā)揮調(diào)節(jié)功能最為普遍的一種形式，目前發(fā)現(xiàn)的細菌sRNA中絕大多數(shù)都屬于這個類型。sRNAs同靶位mRNA結合后，要么抑制或促進靶標mRNA的轉(zhuǎn)譯，要么加速或減緩靶標mRNA的降解，而且它們大部分都依賴于和RNA伴侶Hfq的結合發(fā)揮作用。

1.3.1 sRNAs與目標mRNA通過不完全的堿基配對結合后，影響RNA酶對靶mRNA的作用，對基因表達進行調(diào)節(jié) 例如，sRNA分子RyhB對靶基因sodB、sdhC、fumA等的調(diào)節(jié)。RyhB全長90 nt，主要作為轉(zhuǎn)錄后抑制子影響mRNA的穩(wěn)定性，從而對鐵的代謝進行調(diào)節(jié)。RyhB的表達受Fur蛋白抑制。研究發(fā)現(xiàn)Fur蛋白通過負調(diào)控RyhB來間接調(diào)控細菌內(nèi)儲鐵蛋白基因(bfr)和細胞內(nèi)那些含鐵的非必需元件基因(sodB、sdhC、fumA)的表達。當細胞內(nèi)鐵缺乏時，F(xiàn)ur蛋白失活，RyhB表達水平升高,與sodB、sdhC、fumA和bfr等基因的mRNA配對后，通過與RNase E形成降解復合體對這些基因的mRNA進行降解[18]，從而減少鐵的儲存和消耗[14]。

同時，sRNA除了通過堿基配對促進靶標mRNA降解之外，有些細菌sRNA可以結合在靶標mRNA的3'端，起到穩(wěn)定靶標mRNA的作用。

1.3.2 sRNA調(diào)節(jié)子與靶mRNA互補配對后，也可通過影響靶mRNA與核糖體結合，對目的基因表達進行調(diào)節(jié) 例如，Spot42和OxyS能夠封閉靶mRNA的核糖體結合位點抑制靶基因的表達，DsrA和RprA與靶RNA配對結合后則可暴露其核糖體結合位點促進目的基因轉(zhuǎn)譯。

sRNA Spot42 全長 109 nt，能夠?qū)?gal操縱子進行調(diào)節(jié)，從而使UDP-半乳糖差向異構酶（由galE基因編碼）和半乳糖激酶（由galK基因編碼）的比例發(fā)生改變，以適應不同的生存環(huán)境。這個sRNA可與galE mRNA的一些序列配對，而這些序列與galK基因的核糖體結合位點相互重疊，從而阻斷galk的轉(zhuǎn)譯，而galE的表達未受影響, 因此使得galK編碼的半乳糖激酶和由galE編碼的UDP-半乳糖-4-差向異構酶水平發(fā)生改變以應對不同的生存狀態(tài)[15]。

OxyS對轉(zhuǎn)錄激活因子fhlA的調(diào)節(jié)也是通過與fhlA的mRNA配對結合，封閉核糖體結合位點，阻止核糖體與fhlA的結合，阻止核糖體與fhlA的結合，抑制fhlA的轉(zhuǎn)譯而實現(xiàn)[16]。

sRNA與靶mRNA結合后也能釋放核糖體結合位點從而激活基因的表達。正常細胞狀態(tài)下，rpoS基因5'端非轉(zhuǎn)譯區(qū)以折疊的形式存在，掩蓋了核糖體結合位點，使其轉(zhuǎn)譯處于關閉狀態(tài)。饑餓、滲透壓等條件下，DsrA和RprA與rpoS的mRNA 5'端UTR配對結合，釋放SD序列，暴露核糖體結合位點，促進rpoS蛋白的轉(zhuǎn)譯，增加大腸桿菌對不利環(huán)境的適應性[17]。

1.3.3 RNA 分子伴侶蛋白 Hfq sRNA 與靶 mRNA 的配對大多需要Hfq的參與。Hfq分子量為11.2 kDa，最初是作為大腸桿菌RNA噬菌體Q復制所需要的宿主因子而被發(fā)現(xiàn)[18]。進一步研究表明Hfq與真核細胞和古細菌細胞體內(nèi)的剪切體，mRNA降解復合體中的核心蛋白Sm和Sm樣蛋白同源[19]。

Hfq由一個a螺旋和5個β折疊形成同源六聚體，能夠與單鏈RNA中富含A、U的序列結合，增加sRNA的穩(wěn)定性。Hfq參與sRNA轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的機制還不清楚。目前有兩種推測。第一種是Hfq與sRNA結合后，改變sRNA的結構，暴露出與靶mRNA配對的序列，與靶mRNA形成sRNA-mRNA 穩(wěn)定結構，Hfq本身的結構并不改變。另一種則是Hfq同時使sRNA和mRNA的局部濃度升高，利于sRNA-mRNA復合物的形成[20]。

2 sRNA作用

sRNA對細菌的生長、繁殖具有重要的調(diào)節(jié)作用，它們的主要功能是感應環(huán)境的變化，調(diào)控細胞的代謝途經(jīng)、生長方式使之與環(huán)境相適應，以及控制細菌毒力基因的表達。因此，sRNA與細菌適應外界環(huán)境、營養(yǎng)代謝以及毒力基因表達有著密切關系。以下將對sRNA在調(diào)控細菌的鐵代謝、群體感應及生物膜形成、適應環(huán)境變化以及調(diào)控毒力基因的表達等過程中的相關功能進一步詳述。

2.1 細菌sRNA與鐵離子sRNA能迅速關閉許多蛋白質(zhì)的合成, 改變細胞必需營養(yǎng)物。其中，鐵離子就是典型的例子。鐵是細菌生命活動必需的營養(yǎng)元素之一，但濃度過高會對細菌產(chǎn)生毒害作用，因此，大多數(shù)細菌利用鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白（Fur）調(diào)控鐵的吸收、轉(zhuǎn)運和利用。最近研究表明，細菌中某些sRNA可調(diào)節(jié)鐵代謝過程中多個基因的表達，其中研究最深入的是大腸桿菌中受Fur調(diào)控的sRNA RyhB，RyhB是細菌感受到環(huán)境中鐵離子濃度下降時表達的一種sRNA，它可以下調(diào)多種靶標。當環(huán)境中鐵濃度過高時，F(xiàn)ur蛋白與鐵結合，處于這種構象的Fur蛋白能夠結合RyhB基因，并阻止其轉(zhuǎn)錄，從而使細菌鐵儲存蛋白和非必需的鐵硫蛋白基因（如超氧化物歧化酶基因sodB，sdhCDAB操縱子等）大量表達，鐵離子被迅速利用，細胞內(nèi)鐵濃度維持正常水平[21,22]。當環(huán)境鐵濃度較低時，F(xiàn)ur蛋白失去鐵原子發(fā)生構象改變，不再能夠與RyhB基因結合，失去了對RyhB基因轉(zhuǎn)錄的阻遏作用，于是RyhB得以表達。RyhB通過與鐵儲存蛋白和非必需的鐵硫蛋白mRNA部分序列的堿基配對，降低其mRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)譯效率，使其表達受抑制，從而減少鐵的儲存和消耗[23]，讓更多的鐵能夠被節(jié)省下來用于細菌最基本的生理需求。

2.2 調(diào)控細菌群體感應和生物膜形成在細菌生長過程中，能夠釋放特定信號分子，使細菌可以感知周邊環(huán)境中的同類數(shù)量，以此來調(diào)節(jié)自身多種基因的表達，這種現(xiàn)象稱為群體感應（quorum sensing，QS），而這類信號分子稱為自體誘導子（autoinducer，AI）。這是一種對細菌群體的基因表達調(diào)控, 也是一種細菌細胞間的通訊方式。AI擁有可以自由進出細胞膜的性質(zhì)，因此，隨著細菌在一個封閉環(huán)境中的細胞數(shù)目不斷增加，細胞外的信號分子，即AI分子的濃度也不斷提高；當AI濃度達到一定閾值時，某些特異性基因的表達被啟動，在許多QS系統(tǒng)中，這種基因的啟動是由多種sRNA決定的[24]。

2.3 細菌sRNA感知環(huán)境因素變化并調(diào)控毒力基因的表達細菌sRNA的功能與細菌適應環(huán)境變化有著直接的關系[12]，其功能主要是感受生存條件的改變而調(diào)整細菌的基因表達， 使之適應環(huán)境的變化；當然細菌毒力和細菌生活環(huán)境是相關的，因此，sRNA對細菌的毒力也有巨大的影響[25]。當細菌進入宿主體內(nèi)，細菌感受到環(huán)境的改變，從而調(diào)整自身毒力基因的表達，最有效地促進細菌的生長、繁殖和擴散。多數(shù)情況下，細菌進入機體后，環(huán)境非常適合于細菌的生長，因此細菌會大量表達毒力基因，這些毒力基因產(chǎn)生的蛋白破壞宿主的正常生理狀態(tài)，從而使環(huán)境更加有利于細菌的生存。一個細菌sRNA通過調(diào)節(jié)一組相關基因的表達，啟動細菌細胞內(nèi)部的相關機制，導致細菌對環(huán)境的變化做出最恰當?shù)姆磻?/p>

細菌sRNA的轉(zhuǎn)錄受到嚴格的調(diào)控，這些調(diào)控因子大多是環(huán)境因素。每種環(huán)境因素至少和某一種sRNA相關，該sRNA可以將環(huán)境改變信號傳導到細菌胞內(nèi)有關基因，并引起一系列的反應。例如低溫、營養(yǎng)缺乏或者應激等惡劣條件均可導致不同的sRNA（如DsrA、RprA等）表達[26]，這些sRNA都能激活RpoS基因，RpoS蛋白是細菌RNA聚合酶的一個特別的亞基（σ因子），具有識別特定啟動子的能力，RpoS基因的激活可以啟動一系列下游基因的表達，使細菌生長適應惡劣的環(huán)境，進入穩(wěn)定生長期（降低繁殖速度）。

總而言之，細菌sRNA在感知環(huán)境變化，進而調(diào)控相關基因表達，適應并改造環(huán)境的過程中起著至關重要的作用。

3 展望

sRNA作為原核生物中新發(fā)現(xiàn)的一類基因表達調(diào)控因子，通過感應外界環(huán)境條件，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達，目前已成為國際上新的研究熱點。雖然已分離的sRNA種類較多并不斷被人們認知，但大多數(shù)sRNA功能未知，其作用機制及其調(diào)控網(wǎng)絡研究仍然處于初級階段。從目前積累的知識分析，原核生物可能借助于這些sRNA對它們的生理系統(tǒng)進行精細調(diào)控，以便適應迅速變化的環(huán)境。因此，深入認識這些sRNA可能開辟一個新的研究領域。

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